石斛屬植物菌根生物學(xué)研究.pdf

1、石斛為我國名貴中藥材，石斛屬多種植物均用作商品石斛藥材。石斛來源植物復(fù)雜，通常以莖的結(jié)構(gòu)特征作為鑒定依據(jù)，但莖的結(jié)構(gòu)特征有限，很難區(qū)分所有的種類，這就要求有更多的形態(tài)特征來輔助鑒定，而根的解剖特點可作為重要的參考依據(jù)之一。目前，石斛約材的需求量的不斷增加，而石斛屬植物生境較為獨特，自然繁殖率低，人工栽培難以大面積推廣，導(dǎo)致天然石斛無序采集，自然資源銳減，部分石斛種瀕臨滅絕。石斛屬植物具有蘭科植物典型的菌根特征，在自然條件下生長的石斛種子

2、萌發(fā)、植株營養(yǎng)生長、生殖生長均需要與菌根真菌共生。 本文系統(tǒng)地研究了石斛屬植物根和菌根的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)特征，對石斛屬植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，研究了石斛屬植物內(nèi)生真菌對金釵石斛和鐵皮石斛的作用，并對能夠促進(jìn)金釵石斛苗生長的內(nèi)生真兇進(jìn)行了分類鑒定。 對中國石斛屬34種植物42個材料根的解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，石斛屬植物根的結(jié)構(gòu)為典型的單子葉植物根的結(jié)構(gòu)，其從外到內(nèi)依次為根被、外皮層、皮層、內(nèi)皮層、中柱鞘、維管束和髓。首次發(fā)

3、現(xiàn)了長距石斛、美花石斛和細(xì)莖石斛根的外皮層通道細(xì)胞外側(cè)，有纖維體(Tilosome)結(jié)構(gòu)的存在。提出了根解剖結(jié)構(gòu)特征如根被最內(nèi)層細(xì)胞的Ⅴ型加厚、外皮層通道細(xì)胞外側(cè)的纖維體、外皮層細(xì)胞的加厚方式、內(nèi)皮層細(xì)胞的形狀及髓的類型可以作為屬下種間的鑒別主要特征；同時指出根被的層數(shù)、細(xì)胞的形狀受石斛生K環(huán)境的影響較大，不易作為分類鑒定的特征；根被的形狀與石斛的附生習(xí)性具有相關(guān)性，在根系附著基質(zhì)的一側(cè)，根被變窄，細(xì)胞受劍擠壓，細(xì)胞層數(shù)也略少于暴露的一

4、側(cè)。比較野生金釵石斛與人工栽培的壯苗和弱苗、野生鐵皮石斛與人工栽培的壯苗和弱苗根的解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，野生石斛與人工栽培的壯苗和弱苗在結(jié)構(gòu)上的差異僅體現(xiàn)在根被的層數(shù)、厚度，維管束的數(shù)量上的變化，其結(jié)果為野生石斛高于人工栽培石斛，人工栽培的壯苗高于弱苗。 首次采用聚類分析的方法，對石斛屬25種植物根的解剖結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，基于根的解剖結(jié)構(gòu)特征建立了石斛屬植物種間的系統(tǒng)發(fā)育樹。該系統(tǒng)發(fā)育樹將25種石斛劃分為4個類群，這與中國植物

5、志描述的石斛屬植物屬下組的劃分具有一定的相關(guān)性。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)中已知石斛屬植物的rDNAITS序列，對本實驗中石斛屬的19種石斛植物構(gòu)建了分子系統(tǒng)發(fā)育樹，考察了石斛屬植物種間的分子親緣關(guān)系。比較基于根的解剖結(jié)構(gòu)特征的種間親緣關(guān)系和分子親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者不具有相關(guān)性；分子親緣關(guān)系與石斛屬植物屬下組的劃分也存在分歧。 通過對石斛屬34種植物42個材料的菌根解剖結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)菌根的主要特征為真菌從根被最外層細(xì)胞或根毛侵

6、入根被組織，主要以菌絲的形式在根被組織中擴(kuò)展，但僅觀察劍金釵石斛根中的真菌充滿某一根被細(xì)胞的現(xiàn)象。菌根真菌從外皮層通道細(xì)胞進(jìn)入皮層紐織，在通道細(xì)胞中既可以菌絲形式直接穿過，也可圍繞細(xì)胞核形成菌絲圈或菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu)；皮層細(xì)胞中還可觀察到有菌根真菌形成的疏松的菌絲團(tuán)、衰敗的菌絲團(tuán)及二者共存的現(xiàn)象，菌絲團(tuán)的形成是蘭科植物菌根形成的典型特征。在一些皮層細(xì)胞中，疏松的菌絲團(tuán)圍繞著衰敗的菌絲團(tuán)存在。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)菌絲團(tuán)在皮層中的分布位置與石斛屬植物附

7、生習(xí)性相關(guān)，根系附著基質(zhì)一側(cè)的皮層細(xì)胞中菌絲團(tuán)密度較高。菌絲團(tuán)主要在皮層中間的細(xì)胞中形成，而皮層最內(nèi)側(cè)1～2層細(xì)胞中，菌絲團(tuán)沒有分布或數(shù)量很少。菌根真菌一般不侵入內(nèi)皮層和中柱，只有大苞鞘石斛和鐵皮石斛的內(nèi)皮層通道細(xì)胞和中柱鞘通道細(xì)胞中有菌絲團(tuán)的存在，該現(xiàn)象在石斛屬正常生長著的植物菌根研究中尚為首次發(fā)現(xiàn)。石斛屬植物根的皮層中，菌根真菌的定殖率為0～80％，其中黑毛石斛高達(dá)70％～80％；而長距石斛等的皮層中沒有菌根真菌的定殖。野生石斛、人

8、工栽培的壯苗和弱苗的菌根結(jié)構(gòu)存在差異，弱苗的皮層細(xì)胞中沒有菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu)或者僅存在衰敗的菌絲團(tuán)，其真菌的定殖率也低于野生石斛和人工栽培的壯苗。 首次對石斛屬34種植物42個材料中的內(nèi)生真菌進(jìn)行了系統(tǒng)分離和培養(yǎng)，共分離得劍1313個內(nèi)生真菌菌株，不同的植物其內(nèi)生真菌的數(shù)量不同，內(nèi)生真菌侵染率、分離率也不同。石斛中內(nèi)生真菌的總侵染率分布在25.7％～61.1％；內(nèi)生真菌分離率為0.29～1.18。石斛屬植物內(nèi)生真菌具有多樣性特征，多樣性

9、指數(shù)分布在1.75-4.33之間。根據(jù)內(nèi)生真菌的培養(yǎng)特征，可將出現(xiàn)頻率高的菌株劃分為10個形態(tài)類群，不同形態(tài)類群的菌株在石斛屬植物中的分布不同，發(fā)生頻度也存在著異。 完成了本實驗所得1313株內(nèi)生真菌對石斛苗生長影響的篩選工作。篩選出了36個對金釵石斛苗有促生長作用的菌株、8個對鐵皮石斛苗有促生長作用的菌株；對接種活性菌株的石斛苗根進(jìn)行了侵染檢測，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌均可以侵入石斛苗根的根被組織，部分真菌可以穿過外皮層通道細(xì)胞進(jìn)入皮層組

10、織，其中菌株22-R-4和G08-R-17可以在石斛苗皮層中形成菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu)。這些有促生長作用的真菌一般不能侵染石斛苗根的維管束，而能夠侵染維管束的真菌不利于石斛苗的生長。內(nèi)生真菌還能夠影響石斛苗的化學(xué)成分含量。在瓊脂培養(yǎng)基上，接種菌株22-R-4的金釵石角斗苗總生物堿含量高于未接種組，接菌的鐵皮石斛卣總多糖含量與末接種組相差不大。但在木屑支持物上，接種菌株22-R-4降低了金釵石斛苗總生物堿含量，也降低了鐵皮石斛苗總多糖含量。免疫組織化