家蠶Bmtol基因的克隆鑒定及表達(dá)分析.pdf

1、家蠶是一種鱗翅目昆蟲的模式生物，又是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，在我國擁有相當(dāng)長的馴養(yǎng)歷史。同時，家蠶又屬于變態(tài)發(fā)育昆蟲，在整個生活發(fā)育史中要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹、成蟲4個階段，從幼蟲到成蟲的生長、發(fā)育等過程主要受到保幼激素（Juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）的調(diào)控。而保幼激素結(jié)合蛋白（juvenile hormone binding protein，JHBP）是JH在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和發(fā)揮功

2、能的載體，是Takeout/JHBP蛋白家族的一個總稱。該家族蛋白都含有一個保守的JHBP結(jié)構(gòu)域，同時在N端有兩個Cys殘基形成一個二硫鍵，連接于N末端和α1螺旋的第一個彎曲，被認(rèn)為是該家族蛋白結(jié)合配體的核心部位。對于JHBP的研究，有利于進(jìn)一步闡明家蠶的生長發(fā)育機(jī)理，也有利于蠶絲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
　　takeout（to）基因最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，隨后在其他昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了 to基因的同源基因，而且該基因家族為昆蟲特有。在家蠶中已鑒定出

3、了幾種to基因，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與其他昆蟲的同源基因相類似，但目前對其功能的研究很少。在本研究中，我們通過SilkDB和NCBI數(shù)據(jù)庫篩選出一個新的takeout like（tol）基因，并應(yīng)用生物信息學(xué)分析、基因克隆、原核表達(dá)、Western Blot、激素處理等方法對家蠶體內(nèi)Bmtol基因進(jìn)行鑒定，并對其在家蠶體內(nèi)的表達(dá)和功能進(jìn)行探究，為深入研究JHBP在家蠶體生長、生殖、變態(tài)等發(fā)育中的作用提供理論支持。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　

4、?。?）家蠶Bmtol基因的克隆和生物信息學(xué)分析
　　以家蠶大造品種5齡3天頭部cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增成功克隆出家蠶Bmtol基因。對家蠶Bmtol基因的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，該基因的開放閱讀框ORF為759 bp，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，編碼的氨基酸序列為252個氨基酸，其蛋白理論分子量為27.72 KD，等電點為6.16。該蛋白含有一段23個氨基酸序列的信號肽，并對其進(jìn)行了細(xì)胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白可能是分泌蛋白，

5、親疏水性預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白為親水性蛋白。
　?。?）家蠶Bmtol基因的原核表達(dá)、蛋白純化及抗體制備
　　由于家蠶Bmtol基因編碼的蛋白序列在N端含有一段信號肽，為了能夠成功表達(dá)出該蛋白，故選擇非信號肽的區(qū)域進(jìn)行原核表達(dá)載體的構(gòu)建，表達(dá)載體為pET28（a），表達(dá)菌為E.coli BL21（DE3）。對重組工程菌蛋白表達(dá)條件及可溶性進(jìn)行分析，最后確定28℃、IPTG濃度0.6 mM、誘導(dǎo)時間8 h為原核表達(dá)的最佳條件進(jìn)行重

6、組蛋白的大量表達(dá)。并對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行Ni-NTA親和層析，成功純化出重組蛋白，對重組蛋白進(jìn)行透析、濃縮得到純度和含量都較高的重組蛋白。對濃縮后的重組蛋白制備多克隆抗體，并對抗體進(jìn)行ELISA效價檢測，發(fā)現(xiàn)抗體效價大于512,000，同時對抗體進(jìn)行了特異性檢測，發(fā)現(xiàn)其滿足后續(xù)實驗要求。
　?。?）家蠶Bmtol基因的表達(dá)特征分析和功能初探
　　應(yīng)用RT-PCR和qPCR技術(shù)分析Bmtol基因在家蠶組織的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)該基因

7、主要在家蠶的的頭部有較高的表達(dá)量，其次在表皮和精巢也有表達(dá)，而在其它組織中表達(dá)量很低或沒有，這可能與家蠶個體發(fā)育和生殖發(fā)育的調(diào)控有關(guān)，主要作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。通過RT-PCR檢測中發(fā)現(xiàn)Bmtol主要在每個齡期的起蠶時表達(dá)量較高，從5齡3天到化蛹7天Bmtol基因的表達(dá)量較低，到化蛾后其表達(dá)量又開始上調(diào)，說明Bmtol基因除了參與幼蟲生長發(fā)育的調(diào)控外，還可能參與化蛾后其它調(diào)控。利用Western Blot技術(shù)對BmTOL蛋白在家蠶