植酸酶基因轉(zhuǎn)化棉花及轉(zhuǎn)基因植株再生.pdf

1、本研究采用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化技術(shù)，將外源植酸酶基因(PhyA)導(dǎo)入棉花莖尖分生組織，初步獲得轉(zhuǎn)基因植株；利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將植酸酶基因?qū)朊藁ㄅ咝杂鷤M織，探討農(nóng)桿菌侵染棉花胚性愈傷的轉(zhuǎn)化條件，并獲得抗性胚性愈傷組織；通過(guò)花粉管通道法將PhyA基因?qū)朊藁?，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植株。本研究旨在為棉花現(xiàn)代分子育種增添新的內(nèi)容和新的種質(zhì)材料，同時(shí)為解決農(nóng)作物有效利用土壤有機(jī)磷資源開(kāi)辟一條經(jīng)濟(jì)有效的途徑。 利用棉花莖尖分生組織易于再

2、生的特點(diǎn)，將含有植酸酶基因(PhyA)的質(zhì)粒包裹在金粉上，轟擊轉(zhuǎn)化陸地棉品種農(nóng)大KB18的莖尖分生組織。摸索出了一條適合莖尖再生的途徑。對(duì)轟擊參數(shù)進(jìn)行了綜合比較，優(yōu)選出最佳轟擊組合，確定了適合基因槍莖尖轉(zhuǎn)化體系的梯度篩選法。研究認(rèn)為，培養(yǎng)莖尖的培養(yǎng)基以MSB附加30﹪葡萄糖，不添加或添加少量激素為佳；基因槍轟擊過(guò)程中，采用轟擊壓力1350psi，真空度28inchHg，轟擊距離9cm，轟擊1次，轉(zhuǎn)化效果最佳；轟擊后接入加有1g·L-1活

3、性炭的MSB培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)4-7d，至組織長(zhǎng)出綠芽點(diǎn)時(shí)，將其轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基MSB+Kan(70、80、100、110、130、140mg·L-1)上進(jìn)行梯度篩選，獲得15株卡那霉素抗性植株。PCR分析表明有8株抗性植株含有PhyA基因，PCR-Southern雜交分析進(jìn)一步證實(shí)了PhyA基因在轉(zhuǎn)基因棉花基因組中的整合。從基因槍轟擊到獲得轉(zhuǎn)化小植株大約需要3個(gè)月時(shí)間，最終轉(zhuǎn)化率為2.97﹪。 用質(zhì)粒PC-KSA2300表達(dá)單元轉(zhuǎn)

4、化農(nóng)桿菌菌株EHA105的感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建了可直接用于遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌工程菌株。為了建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，用獲得的農(nóng)桿菌菌株侵染棉花胚性愈傷組織，摸索了影響其轉(zhuǎn)化的因素。結(jié)果表明：不同棉花品種間胚性愈傷組織的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和對(duì)卡那霉素的敏感性有很大差異；農(nóng)桿菌侵染時(shí)間在5-10分鐘、共培養(yǎng)時(shí)在18-21℃條件下培養(yǎng)1-2d，轉(zhuǎn)化效果較好，通過(guò)卡那霉素篩選培養(yǎng)，獲得抗性愈傷組織。對(duì)獲得的愈傷組織進(jìn)行PCR檢測(cè)，初步證明PhyA基因