阿斯匹林抑制卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞增殖及其機(jī)制的研究.pdf

1、本研究以人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3為研究對(duì)象，探討阿司匹林對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的情況，觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，檢測(cè)bcl-2、bax基因的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討阿司匹林誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 研究方法：體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3，以相同濃度種植于96孔板細(xì)胞培養(yǎng)中，在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37℃、CO2含量5％、濕度99％的孵育箱孵育24小時(shí)后，更換含0

2、、0.5、1、2、5、10mmol/L濃度的阿司匹林，分別再孵育24、48、72、96小時(shí)后取出，用MTT還原法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；用1、5、10mmol/L濃度的阿司匹林與SK-OV-3細(xì)胞孵育48小時(shí)，然后用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞周期的影響；用同樣濃度的阿司匹林與SK-OV-3細(xì)胞孵育72小時(shí)，用Giemsa染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(revers

3、e-transcriptionPCR，RT-PCR)的方法，檢測(cè)用藥前后凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的表達(dá)。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)(x±s)表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(1eastsignificantdifference，LSD)作兩兩比較，p＜0.05為有顯著性。 研究結(jié)果： 1.阿斯匹林對(duì)卵巢癌細(xì)胞株增殖的抑制作用：與對(duì)照組比較，阿司匹林作用S

4、K-OV-3細(xì)胞24、48、72、96小時(shí)后，對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并存在著濃度和時(shí)間的依賴性。0.5、1、2、5、10mmol/L阿司匹林作用SK-OV-3細(xì)胞72小時(shí)細(xì)胞的生存率分別為95.60±6.85％、91.23±14.26％、86.07±8.78％、47.96±4.31％、9.39±2.22％，隨著濃度提高，卵巢癌細(xì)胞的生存率出現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)(P＜0.001)，說明阿斯匹林對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的增殖的

5、抑制有明顯的量校關(guān)系。終濃度為5mmol/L的阿斯匹林作用細(xì)胞24、48、72、96小時(shí)，細(xì)胞生存率分別為92.19±5.88％、71.72±2.85％、47.96±4.31％及41.24±8.19％，表明隨著時(shí)間的推移阿斯匹林對(duì)SK-OV-3細(xì)胞增殖的抑制明顯的增加(P＜0.001)，具有明顯的時(shí)效關(guān)系。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組和1、5、10mmol/L濃度的阿斯匹林作用SK-OV-3細(xì)胞48小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯

6、示，SK-OV-3細(xì)胞凋亡率分別為4.15±0.74％、11.76±0.81％、18.18±0.43％、30.83±0.44％。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的凋亡百分比比較，實(shí)驗(yàn)組SK-OV-3細(xì)胞的凋亡率明顯增高(p＜0.001)。且隨著濃度增加，細(xì)胞凋亡的百分比隨之增加，各劑量的阿司匹林作用卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞48小時(shí)，在DNA直方圖上G1期峰前呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡峰即亞G1期峰，說明阿斯匹林可誘導(dǎo)卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞的凋亡。 3.

7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化：對(duì)照組SK-OV-3細(xì)胞的G0/G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)分別為58.93±7.78％和18.04±0.99％；10mmol/L阿司匹林作用48小時(shí)后SK-OV-3細(xì)胞的G0/G1期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)分別為11.03±1.23％和67.47±9.20％。SK-OV-3細(xì)胞經(jīng)不同濃度阿斯匹林作用48小時(shí)后，細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，即隨著阿斯匹林濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例下降，G2/M期細(xì)胞比例升高(p＜0

8、.001)。分析以上結(jié)果可知，阿司匹林在G2/M期阻斷SK-OV-3細(xì)胞增殖。 4.阿司匹林作用后SK-OV-3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：對(duì)照組SK-OV-3細(xì)胞孵育時(shí)貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或多角形，易融合形成集落。終濃度分別為1、5、10mmol/L的阿斯匹林作用卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞72小時(shí)，Giemsa染色后，觀察可見細(xì)胞的偽足回縮，細(xì)胞形態(tài)變小，細(xì)胞間隙變寬，細(xì)胞核濃縮，部分細(xì)胞脫落漂浮于培養(yǎng)液中；高倍鏡下，可見凋亡細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞

9、膜皺縮，染色體濃縮，細(xì)胞核固縮與斷裂，核仁消失，形成大小不等的胞內(nèi)核小體即凋亡小體。與對(duì)照組比較，凋亡細(xì)胞染色加深，尤其細(xì)胞膜染色更明顯。0、1、5、10mmol/L阿司匹林作用SK-OV-3細(xì)胞72小時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果分別為1.1±0.8％,7.67±1.2％，14.92±4.3％，30.67±4.9％，隨著濃度增加，細(xì)胞凋亡率增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性(p＜0.001)。 5.阿司匹林作用SK-O

10、V-3細(xì)胞后細(xì)胞基因組DNA的變化：阿斯匹林作用SK-OV-3細(xì)胞48小時(shí)，細(xì)胞DNA在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上呈現(xiàn)出明顯的梯狀條帶(DNAladder)，表明阿斯匹林可以誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞凋亡。 6.阿司匹林對(duì)SK-OV-3細(xì)胞bcl-2和bax基因mRNA表達(dá)水平的影響：阿司匹林作用SK-OV-3細(xì)胞前、后，SK-OV-3細(xì)胞中bcl-2和bax條帶的積分光密度(bcl-2/β-actin和bax/β-actin)標(biāo)化后分別

11、為0.722±0.335、0.127±0.219和0.224±0.12、0.645±0.24。阿司匹林作用后細(xì)胞中的bcl-2基因mRNA表達(dá)明顯降低，而bax基因mRNA表達(dá)明顯增高，兩種基因表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。 研究結(jié)論：本研究顯示阿司匹林可抑制卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，可將在G2/M期阻止SK-OV-3細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下可觀察到典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化。本研究還首次發(fā)現(xiàn)阿司匹林誘導(dǎo)卵巢癌SK