mTOR信號通路和GOLPH3在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和臨床意義.pdf

1、背景和目的：膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占成人顱內(nèi)腫瘤的50％-60％。在治療上，以手術(shù)治療為主，因腫瘤浸潤性生長，多數(shù)腫瘤與正常腦組織無明確的界限，不能徹底切除，因而術(shù)后多需要進(jìn)行放射治療、化學(xué)治療等多種輔助療法。由于腫瘤的惡性生物學(xué)特性，即使進(jìn)行了綜合治療，腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)幾乎也是不可避免的。其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme，GMB)惡性程度最高，具有很強(qiáng)的增殖和侵襲能力，復(fù)發(fā)率很

2、高，患者的預(yù)后極差，經(jīng)過手術(shù)治療、放療及化療等綜合治療的患者，平均生存期仍不到1年，2年生存率為10％，僅有不到5％的病人可長期生存。因此，深入研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，可以進(jìn)一步提高對膠質(zhì)瘤的認(rèn)識及總體的治療水平研究。
　　 細(xì)胞的增殖與凋亡維持著組織的動態(tài)平衡，一旦細(xì)胞發(fā)生異常增殖或凋亡抑制，則可導(dǎo)致正常的組織細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化?？梢酝ㄟ^遏制腫瘤細(xì)胞的異常增殖或者促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡來有效的遏制腫瘤細(xì)胞的新生及發(fā)展?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)在

3、腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究中，增殖和凋亡一直是研究的熱點。和其他惡性腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤中也存在細(xì)胞的異常增殖及凋亡的抑制，涉及多種基因的異常表達(dá)或抑制。
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與多種病理和生理過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活與乳腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等多種實體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)

4、，已成為腫瘤治療的重要靶點，本研究的第一部分通過免疫組化檢測87例膠質(zhì)瘤病例中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的三個關(guān)鍵蛋白，pAKT、pmTOR和p-p70S6K以及survivin和Ki-67的表達(dá)探討它們在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床病理意義及相互關(guān)系。
　　 GOLPH3又稱GPP34、GMx33、MIDAS，由5p13基因編碼，分子量約30KD，最初是在對小鼠高爾基體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析時發(fā)現(xiàn)的，它屬于高爾基體基質(zhì)蛋白，從酵母到

5、人類高度保守。GOLPH3(GMx33)與高爾基體反面的基質(zhì)動態(tài)相連，快速從TGN移動到細(xì)胞質(zhì)，并分布于細(xì)胞內(nèi)分泌泡和細(xì)胞質(zhì)膜Scott KL等通過對多種實體腫瘤進(jìn)行基因組分析發(fā)現(xiàn)，GOLPH3在乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞性肺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中存在過量表達(dá)。體外實驗發(fā)現(xiàn)GOLPH3過表達(dá)時腫瘤細(xì)胞的體積變大、細(xì)胞周期縮短、有絲分裂加快并且在瓊脂糖凝膠上形成的瘤塊體積明顯增大，而應(yīng)用小干擾RNA或基因敲除技術(shù)降低GOLPH3的表達(dá)

6、時，腫瘤細(xì)胞體積縮小、有絲分裂分減慢同時在瓊脂糖凝膠上形成的瘤塊體積變小，體內(nèi)實驗結(jié)果與此相同。這提示GOLPH3可能是一個致癌蛋白，具有影響腫瘤細(xì)胞的分化、增殖的作用。本研究的第二部分通過檢測87例膠質(zhì)瘤病例中高爾基磷酸化蛋白-3(GOLPH3)的表達(dá)，探討GOLPH3是否是膠質(zhì)瘤可能的分子發(fā)病機(jī)制。
　　 材料和方法：本研究的第一部分收集了山東大學(xué)齊魯醫(yī)院和聊城市腦科醫(yī)院87例膠質(zhì)瘤的蠟塊標(biāo)本和臨床資料，采用半定量免疫組化染

7、色(Envision法)檢測pAKT、pmTOR和p-p70S6K以及survivin和Ki-67的表達(dá)強(qiáng)度，分析它們與常見臨床病理參數(shù)化之間的關(guān)系：本研究的第二部分應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR和Western-blot研究76例液氮凍存膠質(zhì)瘤組織中GOLPH3的表達(dá)情況，分析它與膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：87例膠質(zhì)瘤病例中Ⅰ～Ⅱ級27例，Ⅲ級24例，Ⅳ級36例。pAKT、pmTOR和p-p70S6K以及Ki-67和surviv

8、in定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，在腫瘤組織中呈彌漫或片狀分布，以細(xì)胞膜、胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。pAKT在各級膠質(zhì)瘤中的陽性率分別為Ⅰ～Ⅱ級70.4％(19/27)，Ⅲ級70.8％(17/24)，Ⅳ級75％(27/36)；pmTOR在各級膠質(zhì)瘤中的陽性率分別為Ⅰ～Ⅱ級77.8％(21/27)，Ⅲ級75％(18/24)，Ⅳ級72.2％(26/36)；p-p70S6K在各級膠質(zhì)瘤中的陽性率分別為Ⅰ～Ⅱ級63％4(17

9、/27)，Ⅲ級70.83％(17/24)，Ⅳ級80.6％(29/36)。pAKT、pmTOR和p-p70S6K在各級別膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)率無顯著差異(P>0.05)。有42例同時表達(dá)pmTOR、pAKT和p-p70S6K，另外45例膠質(zhì)瘤組織中三者僅有一種或兩種表達(dá)，顯示在不同的個體中mTOR信號通路激活水平不盡相同。pAKT、pmTOR和p-p70S6K的表達(dá)水平在Ⅲ級和Ⅳ級病例中明顯高于Ⅰ～Ⅱ級，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，

10、說明pAKT、pmTOR和p-p70S6K的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤病理級別的增高而升高。統(tǒng)計學(xué)分析顯示三者的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小和術(shù)前KPS評分無關(guān)(P>0.05)；survivin的陽性率為Ⅰ～Ⅱ級70.4％(19/27)，Ⅲ級75％(18/24)，Ⅳ級91.7％(33/36)。survivin在低級別的膠質(zhì)瘤中染色以淡黃色為主，染色細(xì)胞所占百分比較少，隨著腫瘤病理分級的增高，染色逐漸加深，陽性細(xì)胞所占百分比亦增多，sur

11、vivin的表達(dá)強(qiáng)度在Ⅲ級和Ⅳ級病例中明顯高于Ⅰ～Ⅱ級，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明它的表達(dá)強(qiáng)度隨著膠質(zhì)瘤病理級別的增高而升高。
　　 76例液氮凍存膠質(zhì)瘤組織采用RT-PCR與Western-blot方法檢測GOLPH3的表達(dá)。RT-PCR檢測了包括9例正常腦組織和76例不同級別膠質(zhì)瘤中GOLPH3基因水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GOLPH3基因在正常腦組織中不表達(dá)，76例膠質(zhì)瘤中40例可見表達(dá)，差異明顯(x2=8.9474，

12、P=0.0028)不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)率為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤63.64％(7/11)、星形細(xì)胞瘤Ⅲ級52％(13/25)、Ⅱ級51.85％(14/27)和Ⅰ級46.15％(6/13)，各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；GOLPH3基因的表達(dá)值在Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分別為(14.17±2.32)％、28.14±2.98)％、(60.15±4.39)％、(88.57±5.26)％，差異顯著(P<0.01)。Western-b

13、lot的檢測結(jié)果與RT-PCR一致，顯示不同級別膠質(zhì)瘤組織中GOLPH3的陽性表達(dá)率無顯著性差異，而其表達(dá)值隨病理級別增高有明顯升高的趨勢，高級別的膠質(zhì)瘤中GOLPH3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，其上調(diào)程度與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.mTOR信號通路各關(guān)鍵蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與膠質(zhì)瘤的惡性程度有關(guān)，在高級別的膠質(zhì)瘤中表達(dá)強(qiáng)度高于低級別的膠質(zhì)瘤，可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。臨床上可根據(jù)