無(wú)選擇標(biāo)記基因的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物研究.pdf

1、目前，幾乎所有的植物遺傳轉(zhuǎn)化都要使用選擇標(biāo)記基因，諸如抗生素或除草劑抗性基因等來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子，雖然仍無(wú)直接研究結(jié)果表明選擇標(biāo)記基因影響人類健康或環(huán)境安全，但近年來(lái)人們對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性的擔(dān)心卻與日俱增。為了消除轉(zhuǎn)基因食品的安全性顧慮，無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)運(yùn)而生。結(jié)球甘藍(lán)在我國(guó)蔬菜周年供應(yīng)中占有重要地位。菜青蟲(chóng)、小菜蛾等害蟲(chóng)是甘藍(lán)生產(chǎn)的主要障礙之一，常造成甘藍(lán)的大幅度減產(chǎn)或品質(zhì)下降。但迄今為止，通過(guò)常規(guī)育種方法選育抗蟲(chóng)的蔬菜新品種尚未取得

2、重大進(jìn)展，鑒于基因工程在農(nóng)作物品種改良方面取得的巨大成功，通過(guò)轉(zhuǎn)基因途徑向甘藍(lán)等蔬菜導(dǎo)入抗蟲(chóng)基因成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。大豆kunitz蛋白酶抑制劑(SKTI)是一種主要存在于大豆種子中的蛋白酶抑制劑。通常認(rèn)為這種蛋白酶抑制劑的生理功能是作為儲(chǔ)藏蛋白，調(diào)節(jié)內(nèi)源蛋白酶的活性，以及保護(hù)種子不受昆蟲(chóng)和病原菌的侵害等，是一種天然的抗蟲(chóng)物質(zhì)。更為重要的是，現(xiàn)已證實(shí)蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)入食用作物中，對(duì)人畜沒(méi)有副作用。因此，將該蛋白酶抑制劑作為抗蟲(chóng)目的基因并結(jié)

3、合無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)將有利于消費(fèi)者的接受。 本研究采用目前在植物抗蟲(chóng)基因工程中廣泛使用的大豆胰蛋白酶抑制劑(SKTI)基因?yàn)榭瓜x(chóng)目標(biāo)基因，除草劑基因Bar基因作為篩選標(biāo)記基因，為了便于Bar基因的剔除，在構(gòu)建連鎖表達(dá)載體的同時(shí)，將Bar基因表達(dá)盒置于兩個(gè)同向lox位點(diǎn)間。將含Cre基因的植物表達(dá)載體plus-cre，對(duì)得到的抗蟲(chóng)植株進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化，將重組酶基因Cre引入；或單獨(dú)轉(zhuǎn)化煙草、甘藍(lán)，在開(kāi)花時(shí)通過(guò)有性

4、雜交的手段將重組酶基因引入而實(shí)現(xiàn)Bar基因剔除的目的。存在于植株中的Cre基因及相應(yīng)的篩選標(biāo)記可通過(guò)花期自交分離的方法去除，最終獲得僅含抗蟲(chóng)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果包括以下幾個(gè)方面： 1.甘藍(lán)高頻再生—轉(zhuǎn)化體系的建立 甘藍(lán)(鐵頭金剛)種子在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)播種于1/2MS固體培養(yǎng)基中發(fā)芽，以發(fā)芽6～7d(依具體發(fā)芽情況而定)的下胚軸為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA(0.1～0.2mg/L)與BA(1

5、.0～3.0mg/L)的激素組合，篩選芽分化的最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明：下胚軸芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+3.0mg/LBA+0.1mg/LNAA，所形成的甘藍(lán)不定芽在MS基本培養(yǎng)基或MS附加不同濃度NAA上均能生根，在MS+0.1mg/LNAA的培養(yǎng)基中，生根較快，6～7d后即分化出不定根。 為了測(cè)定外植體對(duì)卡那霉素(kanamycin，kan.)的敏感性，在篩選出的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加不同濃度的kan.(0、5、10、15、20、

6、30mg/L)，對(duì)下胚軸外植體進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果5mg/Lkan.即可有效抑制甘藍(lán)下胚軸芽分化，此濃度用作篩選標(biāo)記基因(NPTII)甘藍(lán)抗性芽的篩選濃度。 測(cè)定外植體對(duì)草丁膦(Phosphinothricin，ppt.)的敏感性，在篩選出的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度的ppt(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L)，對(duì)下胚軸外植體進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果2.5mg/Lppt即可有效抑制甘藍(lán)下胚軸芽分化，此濃度用作篩選標(biāo)記

7、基因(BAR)甘藍(lán)抗性芽分化的篩選濃度。 2.SKTI基因的克隆、序列分析及表達(dá)載體構(gòu)建 提取大豆基因組總DNA，PCR擴(kuò)增目的片段?；厥誔CR產(chǎn)物，克隆于pBluescriptSK(PSK)載體后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明所得SKTI克隆片段為660bp，編碼217個(gè)氨基酸。與SangIKSong報(bào)道的SKTI-A序列進(jìn)行比較，核苷酸同源性為99.8﹪，氨基酸序列同源性為100﹪。獲得的SKTI基因經(jīng)一系列中間克隆、連接后得到

8、表達(dá)載體PCABarSKTI，表達(dá)載體經(jīng)PCR、酶切鑒定驗(yàn)證正確無(wú)誤后導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，用于遺傳轉(zhuǎn)化。 3.重組刪除系統(tǒng)在煙草中的功能驗(yàn)證 (1)抗蟲(chóng)基因SKTI轉(zhuǎn)化煙草 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將SKTI抗蟲(chóng)基因、Bar基因連鎖表達(dá)載體PCABarSKTI導(dǎo)入煙草中，獲得了抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草，對(duì)轉(zhuǎn)化植株目的基因(SKTI基因)和篩選標(biāo)記基因(Bar基因)進(jìn)行了PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株均出現(xiàn)預(yù)期的

9、目標(biāo)條帶：660bp左右的SKTI片段，600bp左右的Bar基因片段；而非轉(zhuǎn)化植株都呈陰性，證明外源基因已整合到煙草植株的基因組中。 (2)無(wú)選擇標(biāo)記基因(Bar)的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草獲得及檢測(cè) 通過(guò)二次轉(zhuǎn)化法將重組酶基因(Cre)導(dǎo)入上述已獲得的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草，將位于2個(gè)同向lox位點(diǎn)間的Bar基因剔除，并對(duì)其進(jìn)行ppt抗性檢測(cè)，將所得煙草葉片切成小塊在ppt.10mg/L培養(yǎng)基上發(fā)芽，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)葉片可繼續(xù)再生出綠色的

10、愈傷組織或抗性芽，大多數(shù)葉片逐漸枯黃，不能產(chǎn)生愈傷組織或抗性芽，不再具備ppt抗性。取抗除草劑檢測(cè)中白化的煙草單株，含Bar基因的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草作為陰性對(duì)照，進(jìn)行Bar基因的PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有一個(gè)單株出現(xiàn)Bar基因擴(kuò)增片段，其余單株均未出現(xiàn)相應(yīng)的Bar基因條帶。證明部分轉(zhuǎn)基因煙草中Bar基因已經(jīng)成功剔除，得到了無(wú)選擇標(biāo)記基因的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草。 4.重組刪除系統(tǒng)在甘藍(lán)中的應(yīng)用 (1)抗蟲(chóng)基因SKTI轉(zhuǎn)化

11、甘藍(lán) 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將SKTI基因?qū)敫仕{(lán)中，獲得了抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)，對(duì)轉(zhuǎn)化植株目的基因(SKTI基因)和篩選標(biāo)記基因(Bar基因)進(jìn)行了PCR檢測(cè)，說(shuō)明外源基因已整合到甘藍(lán)植株的基因組中。 (2)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)(SKTI)的抗除草劑檢測(cè) 對(duì)上述3.(1)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)進(jìn)行離體ppt(20mg/L)抗性檢測(cè)，觀察葉片變化情況。7d后，結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因植株葉片逐漸枯黃、白化，而轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的葉片則仍然保持原有的綠色

12、，對(duì)ppt具有一定抗性，說(shuō)明篩選標(biāo)記基因Bar基因已成功導(dǎo)入甘藍(lán)基因組中。 (3)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)(SKTI)的抗蟲(chóng)試驗(yàn) 進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了離體抗蟲(chóng)檢測(cè)，觀察并記錄幼蟲(chóng)生長(zhǎng)、葉片受害情況。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)化抗蟲(chóng)基因的甘藍(lán)(對(duì)照)相比，轉(zhuǎn)基因植株葉片受損程度明顯低于對(duì)照，對(duì)菜青蟲(chóng)具有一定抗性，部分菜青蟲(chóng)致死，部分菜青蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育受阻、延遲羽化時(shí)間。 5.重組酶(Cre)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的獲得 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將

13、重組酶(Cre)基因表達(dá)載體Plus-Cre導(dǎo)入甘藍(lán)，甘藍(lán)下胚軸和子葉在分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2d，根癌農(nóng)桿菌(含表達(dá)載體Plus-Cre)侵染6～8min后黑暗條件下共培養(yǎng)2d，再進(jìn)行抑菌培養(yǎng)6d，轉(zhuǎn)入卡那霉素篩選培養(yǎng)基(MS+3mg/LBA+0.1mg/LNAA+5mg/LKan.+250mg/LCb.)中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)連續(xù)幾次篩選后，逐步淘汰“假轉(zhuǎn)化體”，獲得轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。對(duì)轉(zhuǎn)化甘藍(lán)目的基因(Cre基因)進(jìn)行了PCR檢測(cè)，證明外源基因已整合