溶栓酶基因的克隆及表達(dá).pdf

1、通過纖維蛋白平板篩選、纖溶活性測(cè)定和體外溶栓分析相結(jié)合的方法，成功地從環(huán)境中篩選到一株纖溶活性較高的細(xì)菌菌株。利用細(xì)菌分類鑒定方法對(duì)其形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其與藤黃微球菌的特征相符。根據(jù)細(xì)菌16SrDNA的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出該菌的16SrDNA片段，對(duì)該序列克隆后測(cè)序，并與已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)?！　榱诉M(jìn)一步探討溶栓酶基因的異源表達(dá)特性，根據(jù)豆豉溶栓酶基因前肽-成熟肽的N-端和C-端編碼序列分別設(shè)計(jì)

2、2對(duì)引物，并在引物N-端和C-端分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ識(shí)別序列，分別以解淀粉芽孢桿菌及藤黃微球菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增出豆豉溶栓酶的前肽-成熟肽序列(1059bp)和MLFE成熟肽編碼區(qū)(828bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中，所獲重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，將其克隆到大腸桿菌高效表達(dá)質(zhì)粒pMAL-p2X中，構(gòu)建溶栓酶基因-麥芽糖結(jié)合蛋白基因相融合的表達(dá)質(zhì)粒pMAL-pDFE及pMAL-MLFE。

3、 為了實(shí)現(xiàn)豆豉溶栓酶類的異源高效表達(dá)，利用PCR技術(shù)從解淀粉芽孢桿菌DC-4總DNA中擴(kuò)增出α-淀粉酶全基因，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步克隆其啟動(dòng)子-信號(hào)肽編碼序列。 對(duì)豆豉溶栓酶工程菌株WB-DFE5(WB600/pSU-AmyDFE)進(jìn)行了搖瓶條件下的發(fā)酵研究，確定了發(fā)酵的優(yōu)化條件。 為了進(jìn)一步提高溶栓酶的表達(dá)水平，從枯草桿菌WB600中克隆了果聚糖蔗糖酶基因的啟動(dòng)子-信號(hào)肽編碼序列(sacR)并與proDFE形成融合基因(