豬圓環(huán)病毒2型-豬瘟病毒共感染細胞的蛋白質組研究.pdf

1、隨著規(guī)?；B(yǎng)殖技術的不斷進步和發(fā)展、交通運輸?shù)目旖莸纫蛩?，增加了豬群之間的接觸機會，也為病原體的流行和傳播創(chuàng)造了機會，造成發(fā)病豬群呈現(xiàn)兩種或多種病原的混合感染的現(xiàn)狀。越來越多的研究表明PCV2和CSFV在豬體內(nèi)能夠發(fā)生共感染，并且臨床的研究表明PCV2能干擾CSFV弱毒疫苗的保護效力，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。然而，PCV2-CSFV共感染時相互作用和對宿主的影響機制還未知。
　　在本研究中，為獲得效價較高的CSFV C株的多克

2、隆抗體，利用PEG6000濃縮法和蔗糖密度梯度離心純化法，制備純化的CSFV樣品。結果表明，經(jīng)濃縮純化的CSFV仍具有較高的感染活性，且毒價為病毒原液的1015倍以上。將純化的CSFV作為抗原接種新西蘭大白兔，獲得特異性和效價均較高的抗CSFV兔多抗血清。
　　為了有效地研究PCV2和CSFV共感染過程中病毒的交互影響以及細胞參與病毒復制的潛在機制，建立了一個的體外共感染模型。在該模型下PCV2不受CSFV復制影響，CSFV對PC

3、V2沒有免疫排斥現(xiàn)象;而CSFV的增殖卻以PCV2劑量依賴性的方式降低。PCV2和CSFV能定位于同一個細胞，且CSFV的E2從正常的細胞質定位，易位到細胞核中。此外，相同劑量的PCV2感染PK15和PK15-CSFV，PCV2的感染率相同，并且介導的細胞凋亡程度無顯著性差異;然而，PCV2劑量與細胞凋亡呈現(xiàn)正相關，表明PCV2介導的凋亡可能與CSFV復制下調有關。另外，滅活PCV2及PCV2病毒成分孵育細胞不能介導細胞凋亡或影響CSF

4、V復制，表明PCV2復制介導的凋亡影響CSFV復制。這些結果足以解釋臨床上PCV2和CSFV共同感染導致更嚴重的臨床癥狀，以及CSFV弱毒疫苗免疫失敗問題。
　　為了探究在PCV2和CSFV共感染過程中涉及的宿主因子和分子機制，使用iTRAQ標記結合LC-MS/MS質譜鑒定技術，分析陰性(NE)、PCV2單獨感染(SP)、CSFV單獨感染(SC)和PCV2-CSFV共感染(PC)的PK15樣品的整體蛋白質組表達情況。在3次重復實驗

5、中，共有3932個蛋白均檢測到。以表達比例≥1.2或≤0.83且p≤0.05作為上下調的閾值，與NE相比，SP中上、下調蛋白數(shù)分別為304個和198個，SC中分別為60個和61個，PC中分別為196個和156個。相對定量PCR、蛋白免疫印跡和共聚焦激光掃描顯微鏡技術驗證的結果表明，大部分基因/蛋白的表達趨勢與iTRAQ蛋白質組結果一致。聚類、GO和KEGG分析證明在PCV2和CSFV共感染過程中PCV2具有主導作用。對PC/SC差異表達

6、蛋白進行IPA分析，結果顯示蛋白14-3-3ζ、cullin3、ERK1/2、caspase和NF-κB可能在PCV2影響CSFV在體外完成生命周期的過程中具有重要作用。另外，進一步對共感染條件下特異性差異表達的184個蛋白進行KEGG和IPA分析，結果表明線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ的多個蛋白均下調表達，由此推斷線粒體可能是PCV2和CSFV共感染時的主要靶標;除了線粒體功能失常外，共感染還特異性影響了氧化磷酸化、Nrf2介導的氧化應

7、激、tRNA裝載、Myc介導的凋亡信號傳導和細胞內(nèi)多種代謝通路的信號通路。這些數(shù)據(jù)為研究PCV2和CSFV共感染過程對細胞通路的影響及其分子機制提供參考。
　　綜上，本研究獲得了高效價高純度的CSFV C株病毒以及抗CSFV的兔多抗，為檢測CSFV提供工具;建立了PCV2和CSFV共感染模型，確定共感染過程中PCV2介導的細胞凋亡是削弱CSFV復制的原因;通過基于iTRAQ的蛋白質組學和生物信息學分析，證明了PCV2和CSFV共感