肺炎鏈球菌耐藥克隆在抗生素選擇壓力下的適應(yīng)性.pdf

1、背景：
　　 肺炎鏈球菌是臨床重要病原菌之一,近年來,在肺炎鏈球菌對青霉素、大環(huán)內(nèi)酯類等藥物耐藥性普遍上升的同時(shí),上海地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)Taiwan19F-14等國際耐藥克隆株的流行是肺炎鏈球菌耐藥性上升的重要原因。
　　 目的：
　　 探索肺炎鏈球菌適應(yīng)性評價(jià)的方法,初步比較肺炎鏈球菌國際耐藥克隆株和非流行耐藥株在無抗菌藥選擇壓力和存在抗菌藥選擇壓力下的適應(yīng)性,探討肺炎鏈球菌耐藥性增長和國際耐藥克隆株流行增多的原因。

2、
　　 方法：
　　 1.菌落計(jì)數(shù)法和分光光度法測定肺炎鏈球菌生長曲線和殺菌曲線的比較:選用肺炎鏈球菌國際耐藥克隆Taiwan19F-14、Spain23F-1菌株各一株和肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49619,通過分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法分別測定細(xì)菌在不加抗生素和加入抗生素的不同生長時(shí)間培養(yǎng)液的OD600值和菌落濃度,描繪生長曲線和殺菌曲線。采用修正的Gompertz方程擬合細(xì)菌的生長曲線并計(jì)算生長動力學(xué)參數(shù),對兩種實(shí)驗(yàn)方

3、法所繪制的生長曲線和殺菌曲線進(jìn)行比較。
　　 2.肺炎鏈球菌國際耐藥克隆菌株和非流行耐藥株在無抗菌藥選擇壓力下適應(yīng)性的比較和分析:選取上海地區(qū)常見的肺炎鏈球菌國際耐藥克隆株(Taiwan19F-14,Spain23F-1,Spain6B-2,Taiwan23F-15)及非流行耐藥株,使用心腦浸出液作為培養(yǎng)基。采用分光光度法制作肺炎鏈球菌生長曲線,采用修正的Gompertz方程擬合細(xì)菌的生長曲線并計(jì)算生長動力學(xué)參數(shù),比較國際耐藥克

4、隆菌株和非流行耐約株之間及不同的國際耐藥克隆菌株之間在無抗菌藥選擇壓力下的適應(yīng)性差異。
　　 3.肺炎鏈球菌國際耐藥克隆菌株和非流行耐藥株在抗菌藥選擇壓力下適應(yīng)性的比較與分析:以阿莫西林、頭孢克洛2個(gè)治療社區(qū)呼吸道感染的常用藥物作為研究藥物。選用上海地區(qū)常見的肺炎鏈球菌國際耐藥克隆菌株(Spain23F-1,Taiwan19F-14,Spain6B-2,Taiwan23F-15)及非流行耐藥株,采用菌落計(jì)數(shù)法制作阿莫西林和頭孢克

5、洛對肺炎鏈球菌的殺菌曲線。通過比較殺菌曲線中達(dá)到99.9％殺菌牢的時(shí)間和抗生素濃度,評價(jià)肺炎鏈球菌在該濃度抗生素選擇壓力下的適應(yīng)性差異。通過計(jì)算亞抑菌濃度抗生素曲線的世代時(shí)間,比較肺炎鏈球菌在亞抑菌濃度抗生素選擇壓力下的適應(yīng)性。綜合以上情況分析國際耐藥克隆和非流行耐藥株之間及國際耐藥克隆株之間在阿莫西林、頭孢克洛選擇壓力下的適應(yīng)性差異。探討阿莫西林和頭孢克洛對國際耐藥克隆不同的選擇壓力。
　　 結(jié)果：
　　 1.菌落計(jì)數(shù)

6、法和分光光度法測定肺炎鏈球菌生長曲線和殺菌曲線比較:在肺炎鏈球菌生長曲線的對數(shù)期,菌液的OD600值和菌落濃度之間有很好的相關(guān)性,并確定了兩者的函數(shù)關(guān)系,其中Taiwan19F-14為Y=2.0242X+6.7640,相關(guān)系數(shù)R2=0.6961,顯著性檢驗(yàn)結(jié)果(F=16.036,P=0.005＜0.05);Spain23F-1為Y=1.5789X+6.7021,相關(guān)系數(shù)R2=0.7700,顯著性檢驗(yàn)結(jié)果(F=26.780,P=0.001

7、＜0.05),回歸方程均有顯著性意義。分光光度法擬合的1/2MIC,1MIC藥物濃度殺菌曲線與對照曲線相比無明顯下降趨勢,計(jì)算得到的1/2MIC和1MIC藥物濃度的世代時(shí)間與對照曲線世代時(shí)間的比值要明顯小于菌落計(jì)數(shù)法。分光光度法測定的RF1C(1.5897)＜菌落計(jì)數(shù)法測定的RF1C(3.9894),分光光度法測定的RF1/2C(1.0685)＜菌落計(jì)數(shù)法測定的RF1/2C(1.7721),分光光度法測定的RF1A(0.9943)＜菌落

8、計(jì)數(shù)法測定的RF1A(2.1798),分光光度法測定的RF1/2A(0.9915)≈菌落計(jì)數(shù)法測定殺菌曲線的RF1/2A(0.9094)。分光光度法所測定殺菌曲線中達(dá)到99.9％殺菌率的2MIC濃度曲線,基本與x軸相重合。
　　 2.肺炎鏈球菌國際耐藥克隆菌株和非流行耐藥株在無抗菌藥選擇壓力下適應(yīng)性的比較和分析:國際耐藥克隆株世代時(shí)間的平均值(0.2867h)較非流行耐藥株(0.3122h)短。4個(gè)耐藥克隆菌株間的世代時(shí)間比較,

9、Taiwan19F-14、Taiwan23F-15、Spain23F-1相似并明顯短于Spain6B-2,分別為0.2834h、0.2760h、0.2689h、0.3923h。耐藥克隆復(fù)合體中世代時(shí)問的比較,dlvTaiwan19F-14(0.2488h)＜slvTaiwan19F-14(0.2775h)＜Taiwan19F-14(0.2962h),slvSpain23F-1(0.2662h)＜Spain23F-1(0.2717h)。<

10、br>　　 3.肺炎鏈球菌國際耐藥克隆菌株和非流行耐藥株在抗菌藥選擇壓力下適應(yīng)性的比較與分析:國際耐藥克隆菌株對照曲線的世代時(shí)間平均值(0.1797h)小于非流行耐藥株(0.1920h)。在2MIC濃度下,阿莫西林和頭孢克洛對非流行耐藥株的殺菌效果較國際耐藥克隆強(qiáng)。比較不同菌株在1/2MIC亞抑菌濃度選擇壓力下的世代時(shí)間,所有國際耐藥克隆菌株的G1/2A(0.2413h)＞非流行耐藥株的G1/2A(0.2280h),其中Taiwan1

11、9F-14耐藥克隆菌株的G1/2A(0.2470h)＞非流行耐藥株的G1/2A。所有國際耐藥克隆菌株的G1/2c(0.2416h)＜非流行耐藥株的G1/2C(0.2698h),其中Taiwan19F-14耐藥克隆菌株的G1/2C(0.2651h)＜非流行耐藥株的G1/2C。
　　 阿莫西林對Spain23F-1耐藥克隆菌株的殺菌效果優(yōu)于對slvSpain23F-1耐藥克降菌株,而頭孢克洛對兩者殺菌效果相仿。Spain23F-1耐

12、藥克隆菌株的G(0.1816h)＞slvSpain23F-1耐藥克降菌株的G(0.1681h),Spain23F-1耐藥克隆菌株的G1/2C(0.2765h)＞slvSpain23F-1耐藥克隆菌株的G1/2C(0.1880h),Spain23F-1耐藥克隆菌株的G1/2A(0.2411h)＞slvSpain23F-1耐藥克隆菌株的G1/2A(0.1778h)。藥阿莫西林和頭孢克洛對Spain6B-2、Taiwan23F-15耐藥克隆菌

13、株和非流行耐藥株的殺菌效果相近。阿莫西林對Taiwan19F-14和Spain23F-1耐藥克隆菌株的殺菌效果強(qiáng)于頭孢克洛。計(jì)算國際耐藥克隆菌株和非流行耐藥株的G1/2,所有國際耐藥克隆菌株的G1/2C(0.2416h)≈G1/2A(0.2413h),非流行耐藥株的G1/2C(0.2698h)＞G1/2A(0.2280h),Taiwan19F-14耐藥克隆菌株的G1/2c(0.2651h)＞G1/2A(0.2470h),Spain23F

14、-1耐藥克隆菌株的G1/2C(0.2322h)＞G1/2A(0.2094h)。
　　 結(jié)論：
　　 1.分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法測定的肺炎鏈球菌生長曲線的對數(shù)生長期部分,經(jīng)線性回歸兩者有很好的相關(guān)性。故分光光度法作為測定肺炎鏈球菌生長曲線、計(jì)算生長動力學(xué)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法,與菌落計(jì)數(shù)法比較結(jié)果一致,且更為簡便,可以替代后者用于評價(jià)肺炎鏈球菌在無抗菌藥選擇壓力下的適應(yīng)性。分光光度法測定肺炎鏈球菌殺菌曲線,無法真實(shí)反映殺菌效果,隨

15、藥物濃度增加殺菌曲線無明顯下降趨勢。故分光光度法作為測定肺炎鏈球菌殺菌曲線、評價(jià)殺菌效果的實(shí)驗(yàn)方法,無法替代菌落計(jì)數(shù)法評價(jià)肺炎鏈球菌在抗菌藥選擇壓力下的適應(yīng)性。
　　 2.在無抗菌藥選擇壓力時(shí)和頭孢克洛1/2MIC、2MIC濃度和阿莫西林2MIC濃度的情況下,國際耐藥克隆菌株的適應(yīng)性可能較非流行耐藥株高。在阿莫西林1/2MIC亞抑菌濃度情況下,非流行耐藥株適應(yīng)性可能較國際耐藥克隆高。在無抗菌藥選擇壓力時(shí),Taiwan19F-14

16、、Taiwan23F-15和Spain23F-1耐藥克隆菌株的適應(yīng)性相似都高于Spain6B-2耐藥克隆。
　　 3.頭孢克洛2MIC濃度對國際耐藥克隆菌株的選擇壓力較阿莫西林2MIC濃度大,阿莫西林1/2MIC亞抑菌濃度對國際耐藥克隆菌株的選擇壓力較頭孢克洛1/2MIC亞抑菌濃度大。因此,不同品種和濃度的抗生素可能對國際耐藥克隆菌株和非流行耐藥株有不同的選擇壓力。
　　 4.在無抗菌藥選擇壓力時(shí),適應(yīng)性dlvTaiwa