C肽調(diào)控NF-κB與P300防治糖尿病腎病的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是繼腫瘤、心血管疾病之后第三大非傳染性的慢性疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康。據(jù)報(bào)道，全球已有3.82億人患有DM，預(yù)計(jì)到2035年將達(dá)到5.92億。我國(guó)就有近1億人患有DM，約占全球患病人數(shù)的四分之一，患病率位居世界第一位。糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是1型和2型DM患者的主要并發(fā)癥之一，是終末期腎臟疾病導(dǎo)致患者致死致殘的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約

2、35％~50%1型、約20%2型DM患者發(fā)展成為DN。DN主要病理改變是基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，細(xì)胞外基質(zhì)增加，最終導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化。目前，其發(fā)病的內(nèi)在機(jī)制尚未完全闡明。近年研究確認(rèn)，氧化應(yīng)激是公認(rèn)的DN發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。其關(guān)鍵酶誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)轉(zhuǎn)基因會(huì)引起DN樣病變。iNOS基因轉(zhuǎn)錄最重要的調(diào)控因子是核因子-κB(nuclear factor

3、 kappa B,NF-κB)，當(dāng)受到相應(yīng)刺激時(shí)被激活轉(zhuǎn)位入核，調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。P300是細(xì)胞內(nèi)最重要的共激活因子，具有核蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性，參與多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。研究證實(shí)DM時(shí)，NF-κB的P65亞基與共激活因子P300結(jié)合增多，異常激活基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量iNOS，在DN的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。
　　C肽是含31個(gè)氨基酸的多肽，在胰島素合成過(guò)程中產(chǎn)生，并與胰島素等摩爾分泌。一直以來(lái)，C肽僅作為評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞功能的指標(biāo)。近

4、年來(lái)，一些研究表明對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和DM患者，外源性C肽可以防止或逆轉(zhuǎn)DN。一系列研究發(fā)現(xiàn)生理濃度的C肽能結(jié)合胞膜G蛋白偶聯(lián)受體，或進(jìn)入胞質(zhì)胞核發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。
　　本課題前期研究表明高糖(25 mmol/L)刺激下，0.5 nmol/L的C肽定位于大鼠腎小球系膜細(xì)胞核，抑制iNOS基因轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達(dá)，亦能抑制高糖引起的NF-κB核轉(zhuǎn)位。然而C肽是否通過(guò)調(diào)控NF-κB與P300的相互作用而發(fā)揮防治DN的作用，尚未見相關(guān)報(bào)道。

5、r>　　本研究從細(xì)胞和動(dòng)物整體兩個(gè)方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　采用大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用激光共聚焦顯微鏡(Confocal)觀察C肽(0.5 nmol/L)對(duì)高糖(25 mmol/L)刺激的細(xì)胞中NF-κB的作用及其與P300共定位，用染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技術(shù)檢測(cè)C肽對(duì)NF-κB啟動(dòng)iNOS的調(diào)控作用，用免疫共沉淀(co-immunoprecipi

6、tation,Co-IP)技術(shù)檢測(cè)C肽對(duì)NF-κB與P300相互作用的影響。
　　用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)復(fù)制SD大鼠DM模型，隨機(jī)分為正常組、病理組、C肽防治組、C肽治療組和亂碼C肽組，實(shí)驗(yàn)前后測(cè)定血糖、體重變化，測(cè)定24h尿白蛋白排泄量。取大鼠腎小球皮質(zhì)于光鏡及透射電鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，進(jìn)一步探討 C肽對(duì)防治 DN的整體功效及作用。
　　方法：
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　1.1.細(xì)胞培

7、養(yǎng)
　　大鼠腎小球系膜細(xì)胞株(GMCs)HBZY-1，用含10%胎牛血清的低糖DMEM(5.5 mmol/L)，0.25% EDTA-胰蛋白酶消化傳代，接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　1.2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組
　　(1)Confocal技術(shù)觀察NF-κB P65核轉(zhuǎn)位及其與P300共定位，同時(shí)確定C肽作用的最佳時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分組：
　　1)正常組(Control)：GMCs(HBZY

8、-1)用低糖DMEM(5.5 mmol/L)正常培養(yǎng)；
　　2)高滲對(duì)照組(HO)：GMCs用L-葡萄糖DMEM(25 mmol/L)刺激作用24 h；
　　3)高糖組(HG)：GMCs(HBZY-1)用高糖DMEM(25 mmol/L)刺激作用24 h；
　　4)NF-κB抑制劑(BAY11-7082)加高糖組(IH)：正常培養(yǎng)的GMCs加入BAY11-7082(10μM)孵育1 h，換高糖DMEM(25 mmol/

9、L)刺激作用24 h；
　　5)C肽治療組(CP)：GMCs用高糖DMEM刺激作用24 h后，換成0.5 nmol/LC肽-高糖DMEM分別培養(yǎng)10、20、30、40、50、60min。
　　(2)ChIP技術(shù)檢測(cè)C肽對(duì)NF-κB啟動(dòng)iNOS的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)分組：
　　1)正常組(Control)：GMCs用低糖DMEM(5.5 mmol/L)正常培養(yǎng)；
　　2)高糖組(HG)：GMCs用高糖DMEM(25 mm

10、ol/L)刺激作用24 h；
　　3)C肽治療組(CP)：GMCs用高糖DMEM刺激作用24 h后，換成0.5 nmol/LC肽-高糖DMEM培養(yǎng)30 min。
　　(3)Co-IP技術(shù)檢測(cè)C肽對(duì)NF-κB與P300結(jié)合作用的影響。實(shí)驗(yàn)分組：
　　1)正常組(Control)：GMCs用低糖DMEM(5.5 mmol/L)正常培養(yǎng)；
　　2)高糖組(HG)：GMCs用高糖DMEM(25 mmol/L)刺激作用24

11、 h；
　　3)C肽治療組(CP)：GMCs用高糖DMEM刺激作用24 h后，換成0.5 nmol/L C肽-高糖DMEM培養(yǎng)30 min。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　2.1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組
　　健康雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組(NC,8只)，其余72只注射STZ溶液(STZ溶于濃度為0.1 mol/L的檸檬酸納緩沖液，pH4.4，新鮮配制，終濃度為10 mg/mL，按45 mg/kg腹腔注射)制備D

12、M模型。注射3天后，尾靜脈采血測(cè)血糖值≥16.7 mmol/L，尿糖+++以上，為造模成功。造模成功68只，再隨機(jī)分成4組：病理組(DM，17只)，C肽防治組(DM+CP-P,17只)，C肽治療組(DM+CP-T,17只)，亂碼C肽治療組(DM+scCP,17只),以上五組均于20~25℃室溫下正常飲食喂養(yǎng)。DM+CP-P組在造模成功后，開始皮下注射人C肽(130 nmol/kg)，每天2次，治療6周后停藥。DM+CP-T組和DM+sc

13、CP組在病程6周后，分別開始同劑量皮下注射人C肽或亂碼C肽，每天2次，治療6周。最后股動(dòng)脈放血處死。
　　2.2.檢測(cè)血糖和24 h尿液
　　取尾靜脈血，用血糖儀檢測(cè)并記錄注射STZ前、后第3天和第12周的血糖變化。收集24 h尿液，檢測(cè)尿蛋白排泄量。
　　2.3.形態(tài)學(xué)觀察
　　取大鼠腎小球皮質(zhì)作病理切片，分別于光鏡和透射電鏡下觀察。
　　結(jié)果：
　　1.不同時(shí)間點(diǎn)，C肽對(duì)CP組GMCs NF-κB

14、 P65核轉(zhuǎn)位及其與P300共定位的影響
　　Confocal結(jié)果顯示，高糖刺激GMCs24 h，會(huì)引起NF-κB P65轉(zhuǎn)位入核，且NF-κB P65與P300共定位于細(xì)胞核；0.5 nmol/L C肽治療在30 min時(shí)效果顯著，即NF-κB P65聚集于胞質(zhì)，P300聚集于胞核；40~60 min C肽作用逐漸減弱至基本消失。因此選30 min作為C肽治療高糖長(zhǎng)時(shí)間刺激細(xì)胞最佳的作用時(shí)間。
　　2.ChIP技術(shù)檢測(cè)C肽

15、治療30 min時(shí)，對(duì)CP組GMCs NF-κB啟動(dòng)iNOS的調(diào)控作用
　　高糖刺激GMCs24 h后,細(xì)胞內(nèi)NF-κB在iNOS啟動(dòng)子區(qū)近端的結(jié)合作用(4.44±0.29,P<0.05)與Control組相比明顯升高；0.5nmol/LC肽治療30 min后，細(xì)胞內(nèi)NF-κB在iNOS啟動(dòng)子區(qū)的近端結(jié)合作用(1.86±0.21,P<0.01)與HG組相比顯著下降。
　　高糖刺激GMCs24 h后,細(xì)胞內(nèi)NF-κB在iNOS

16、啟動(dòng)子區(qū)遠(yuǎn)端的結(jié)合作用(5.06±0.43,P<0.05)與Control組相比明顯升高；0.5 nmol/L C肽治療30 min后,細(xì)胞內(nèi)NF-κB在iNOS啟動(dòng)子區(qū)的近端結(jié)合作用(0.94±0.07,P<0.05)與HG組相比明顯下降。
　　3.Co-IP技術(shù)檢測(cè)C肽治療30 min時(shí), Control組、HG組和CP組GMCs NF-κB P65與P300的結(jié)合作用
　　Control組、HG組和CP組細(xì)胞蛋白裂解液

17、分別加入P300抗體沉淀處理后，Western blot結(jié)果顯示：HG組GMCs P65與P300蛋白結(jié)合量(18.31±0.82，P<0.05)比Control組(5.99±0.07)明顯升高；CP組GMCs P65與P300蛋白結(jié)合量(5.220±0.33，P<0.01)比HG組顯著下降。
　　Control組、HG組和CP組細(xì)胞蛋白裂解液分別加入P65抗體沉淀處理后，Western blot結(jié)果顯示：HG組GMCs P300

18、與P65蛋白結(jié)合量(9.19±0.17，P<0.01)比Control組(3.54±0.21)顯著升高；CP組GMCsP300與P65蛋白結(jié)合量(2.98±0.23，P<0.01)比HG組顯著下降。
　　4.大鼠的一般表現(xiàn)，C肽對(duì)DM大鼠血糖、體重和尿白蛋白排泄量的影響造模成功的大鼠逐漸出現(xiàn)消瘦，皮毛疏松無(wú)光澤，反應(yīng)遲鈍，多飲、多尿、多食，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等癥狀。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，DM組和 DM+scCP組病癥更加明顯，而DM+CP-P組

19、和DM+CP-T組病癥與NC組相似。
　　各組大鼠入選時(shí)血糖和體重?zé)o顯著性差異。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，DM+CP-P組平均血糖(29.96±0.52) mmol/L，DM+CP-T組(28.90±0.74)mmol/L,DM+scCP組(29.74±0.66)mmol/L，均與DM組(29.23±0.66)mmol/L無(wú)顯著性差異。以上四組均顯著高于NC組(6.40±0.25)mmol/L(P<0.01)。
　　C肽治療結(jié)束時(shí)，DM+

20、CP-T組平均體重(271.82±8.76)g, DM+scCP組(248.35±7.19)g，均與DM組(249.0±7.13) g無(wú)顯著性差異。以上四組均顯著低于NC組(515.5±14.42)g(P<0.01)。
　　C肽治療結(jié)束時(shí)，DM組24小時(shí)尿蛋白排泄量(327.93±32.58)mg和DM+scCP組(293.79±49.40)mg均明顯高于NC組(15.42±4.06)mg(P<0.05)；DM+CP-P組(55.

21、21±4.06)mg和DM+CP-T組(70.2±9.46) mg明顯低于DM組(P<0.05)。
　　5.腎小球形態(tài)學(xué)觀察
　　腎小球光鏡(×400)下觀察：NC組腎小球未見異常；DM組可見到腎小球結(jié)構(gòu)異常、腎小囊腔增大；DM+scCP組與DM組相似，并且有腎小球壞死的現(xiàn)象；而DM+CP-P組和DM+CP-T組，可見腎小囊腔縮小，與病理組相比有所改善，且DM+CP-P組比DM+CP-T組的病變較輕。
　　腎小球透射電

22、鏡(×20K)下觀察：NC組腎小球未見異常。DM組可見基底膜重度增厚，局部呈丘狀隆起，血管內(nèi)皮細(xì)胞重度增生，部分足細(xì)胞足突融合；DM+scCP組與 DM組相似，基底膜明顯增厚；DM+CP-P組和DM+CP-T組可見基底膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞接近正常，足細(xì)胞足突部分輕度融合，比DM組有明顯改善，且DM+CP-P組較DM+CP-T組的病理改變減輕。
　　結(jié)論：
　　1.C肽調(diào)控NF-κB與P300防治糖尿病腎病的機(jī)制是：
　　(