老年性癡呆腦微血管發(fā)病機(jī)制及通心絡(luò)干預(yù)研究.pdf

1、目的:本研究在中醫(yī)絡(luò)病理論指導(dǎo)下,對老年性癡呆(AD)腦微血管發(fā)病機(jī)制及其在腦神經(jīng)元損傷中的作用進(jìn)行探討,同時闡明依據(jù)絡(luò)病理論建立的復(fù)方制劑一通心絡(luò)(TXL)對AD腦微血管損傷的治療優(yōu)勢以及其通過保護(hù)腦微血管實現(xiàn)保護(hù)腦神經(jīng)元的作用途徑,為本藥臨床治療AD提供有力的實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 本研究分為以下四部分內(nèi)容:
　　 1.AD模型認(rèn)知和記憶功能減退及TXL干預(yù)研究
　　 采用SAMP8小鼠作為研

2、究對象,實驗分為SAMR1空白對照組,SAMP8組、TXL(高、中、低)三個劑量組,石杉堿甲(SSJJ)組,共6個組,每組20只小鼠,小鼠給藥量均為10ml/kg體重,灌胃給藥,每日一次,連續(xù)90日,SAMR1組給予相同體積溶劑。實驗結(jié)束后,觀察各組小鼠一般情況、認(rèn)知記憶功能、腦神經(jīng)元損傷、腦皮層β淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積情況。
　　 2.AD模型腦微血管損傷及TXL干預(yù)研究
　　 本研究繼續(xù)采用SAMP8小鼠作為研究對

3、象,仍以SAMR1為對照,繼第一部分實驗證明了小鼠腦皮層Aβ沉積后,采用免疫組化方法觀察各組小鼠腦微血管數(shù)目改變、內(nèi)皮功能損傷情況、管周炎癥因子的表達(dá)改變。
　　 3.Aβ誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)的損傷及TXL干預(yù)研究
　　 本研究采用細(xì)胞實驗,分為空白組:HBMEC用10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30h;模型組:HBMEC用10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6h后,加入終濃度為20μmol/L Aβ1-42作

4、用24h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷;TXL組:HBMEC用10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并分別加入終濃度為100、200、400ug/ml的TXL預(yù)處理6h后加入終濃度為20μmol/LAβ1-42作用24 h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。SSJJ組:HBMEC用10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并加入終濃度為2μmol/L的SSJJ預(yù)處理6h后加入終濃度為20μmol/l Aβ1-42作用24h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。實驗結(jié)束,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變,SRB檢測細(xì)胞的

5、活性,硝酸酶還原法檢測各組NO水平、ELISA檢測各組細(xì)胞上清液中VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α水平;westernblot檢測eNOS、NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá);RealtimePCR檢測VEGFmRNA的表達(dá)。
　　 4.Aβ?lián)p傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對腦神經(jīng)元影響及TXL干預(yù)研究
　　 本研究采用原代培養(yǎng)腦神經(jīng)元的方法,分為正常神經(jīng)元組(空白組)、正常HBMEC上清液+神經(jīng)元組(正常組)、A

6、β?lián)p傷HBMEC上清液+神經(jīng)元組(模型組)、Aβ?lián)p傷神經(jīng)元組(Aβ?lián)p傷組)、TXL干預(yù)HBMEC上清液+Aβ+神經(jīng)元組(TXL組),SSJJ干預(yù)HBMEC上清液+AD+神經(jīng)元組(SSJJ組),共六個實驗組,空白組加入100％無血清DMEM培養(yǎng)液,Aβ?lián)p傷組加入終濃度為10μmol/lAβ,其余各組均加入50％內(nèi)皮細(xì)胞上清液和50％無血清DMEM培養(yǎng)液,將細(xì)胞置于溫度37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。實驗結(jié)束后倒置顯微鏡下

7、觀察細(xì)胞的形態(tài)改變、HE染色觀察細(xì)胞的形態(tài)改變、免疫熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞壞死和凋亡、MTT檢測各組腦神經(jīng)元的活性、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,westernblot檢測凋亡蛋白酶Caspase-3、凋亡蛋白bax、bcl-2表達(dá),realtimePCR檢測baxmRNA、bcl-2mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.首先運用中醫(yī)絡(luò)病理論探討AD病機(jī)及治療,腦之絡(luò)脈分為運行經(jīng)氣為主的氣絡(luò)與運行血液為主的脈絡(luò),共同成為維持

8、腦神活動的物質(zhì)基礎(chǔ),基于氣血相關(guān)的絡(luò)病理論特色,AD雖病在氣絡(luò),但亦不能忽視脈絡(luò)結(jié)構(gòu)與功能異常對其影響,基于精、氣、神之間相互轉(zhuǎn)化關(guān)系,指出元氣虧虛、氣絡(luò)損傷是AD重要病機(jī),氣虛運血無力,脈絡(luò)瘀阻,脈絡(luò)末端供血供氣、津血互換、營養(yǎng)代謝失常,亦可加重氣絡(luò)損傷,引起腦神失用,成為AD發(fā)病的病理基礎(chǔ),益氣活血通絡(luò)是AD的有效治法。
　　 2.基于中醫(yī)脈絡(luò)與西醫(yī)中、小血管及微循環(huán)解剖形態(tài)相關(guān)性,吸取西醫(yī)學(xué)關(guān)于AD微血管發(fā)病機(jī)制的最新進(jìn)展

9、,突破以往把AD單純理解為神經(jīng)變性性疾病的觀念,從微血管損傷探討AD的發(fā)病機(jī)制,結(jié)果顯示快速老化型模型小鼠腦部微血管出現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能損傷:腦皮層ET-1表達(dá)升高、NO分泌降低,微血管數(shù)目明顯減少,管周炎性因子顯著增加;離體細(xì)胞研究結(jié)果顯示Aβ不僅可以引起HBMEC結(jié)構(gòu)與功能損傷,Aβ與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育的上清液還可明顯誘導(dǎo)腦神經(jīng)元調(diào)亡,這不僅為西醫(yī)學(xué)AD微血管發(fā)病機(jī)制假說提供了實驗依據(jù),也豐富了氣血相關(guān)脈絡(luò)學(xué)說的科學(xué)內(nèi)涵。
　　 3.