骨靈片對人成骨細(xì)胞功能的影響及對p38MAPK信號通路的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景 骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種全身性的骨骼疾病，主要表現(xiàn)為骨組織內(nèi)單位體積中骨量減少，骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)隨年齡的增加(或婦女絕經(jīng)后)等比例的減少，骨組織的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而致其骨組織的正常荷載功能發(fā)生變化。OP的發(fā)病機(jī)制主要是由成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)的骨形成功能不足和破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)的骨吸收亢進(jìn)所導(dǎo)致的，最終導(dǎo)致骨重建平衡被破壞。 OP發(fā)病OB與OC兩種細(xì)

2、胞是相互聯(lián)系和相互影響的。其OPOB所分泌的兩種細(xì)胞因子骨保護(hù)素和護(hù)骨素配體在OP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)是OB表達(dá)的可溶性腫瘤壞死因子受體超家族中的成員;護(hù)骨素配體，又稱細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator ofnuclear factor kapDa B ligand，RANKL)是一種Ⅱ型跨膜蛋白，是OC分化所必需的細(xì)胞因子，具有誘導(dǎo)OC生成作用

3、。OPG能特異性地與可溶性RANKL結(jié)合，從而抑制OC生成、分化和成熟，抑制骨破壞<'[6]>。同時(shí)，OPG對TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡有抑制作用。因此，OPG和RANKL在OC分化、活化過程中占重要地位，參與了骨破壞的基本過程<'[7]>。 OB的生長、分化主要由以絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)，因此，MAPK通路是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生過程中重要細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究證明MAPK通路中：(1)ERK通路主要是轉(zhuǎn)

4、導(dǎo)啟動(dòng)OB分化所需的信號；(2)JNK通路主要是誘導(dǎo)前列腺素E和血管內(nèi)皮生長因子，來促進(jìn)OB分化；(3)p38通路主要介導(dǎo)OPG和/或RANKL的表達(dá)，介導(dǎo)OC的生長與凋亡<'[8-11]>。經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)與研究，在OP的預(yù)防與治療中，中醫(yī)中藥治療有其優(yōu)勢之處。我們課題組根據(jù)骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)辯證中“腎虛血瘀、脾失健運(yùn)”的病理特點(diǎn)，研制了具有補(bǔ)腎壯骨、活血通絡(luò)之功的治療骨質(zhì)疏松癥藥物——骨靈丸。骨靈片是在骨靈丸的基礎(chǔ)上，通過劑型改革研制的。前

5、期的骨質(zhì)疏松大鼠模型實(shí)驗(yàn)以及大鼠OB/OC共育體系實(shí)驗(yàn)等研究顯示骨靈片(丸)(Gu Ling Pian，GLP)能有效防治OP，改善OP大鼠模型以及大鼠OB/OC共育體系的各項(xiàng)指標(biāo)。 研究目的 1．觀察GLP對體外培養(yǎng)的人OB的細(xì)胞增殖率、礦化結(jié)節(jié)數(shù)、OPG/RANKL表達(dá)的影響； 2．探討含GLP對p38 MAPK信號通路的調(diào)控作用，進(jìn)一步從分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制探討GLP的作用機(jī)理，為GLP治療OP提供理論和實(shí)驗(yàn)依

6、據(jù)。 方法 1．取人髂骨松質(zhì)骨，采用改良胰酶-膠原酶消化法分離培養(yǎng)人OB；從細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、特異性酶染色及免疫組化技術(shù)等方面鑒定培養(yǎng)的OB； 2．實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)一分四組：GLP高劑量組(high doses，HD)、GLP中劑量組(middle doses，MD)、GLP低劑量組(low doses，LD)、空白血清對照組(Control)；實(shí)驗(yàn)二中加入為研究GLP對p38MAPK通路的調(diào)控作用，我們采用了p38特

7、異性抑制劑SB203580進(jìn)行干預(yù)，并分四組：SB組(只加入SB203580組)、SB+HD組(加入SB203580和高劑量GLP組)、HD組(只加入高劑量GLP組)、空白血清對照組(Control)； 3．應(yīng)用四唑鹽比色法(MTT)及茜素紅染色法分析GLP對OB的增殖及礦化功能的影響； 4．使用real time PCR、Western-blot等技術(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組中的OPG和RANKL基因表達(dá)以及p38蛋白的變化；

8、 5．統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表示為：均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)，方差齊時(shí)，兩組比較采用LSD，如多組與對照組比較使用Dunnett檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)，采用Welch穩(wěn)健估計(jì)，再采用T<,2>方法兩兩比較。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1．經(jīng)不同濃度含GLP藥液血清作用的單獨(dú)培養(yǎng)的OB各指標(biāo)變化如下： (1)細(xì)胞增殖率：各組細(xì)胞增殖率的總體比較具有顯著性差異(F=24

9、.211P<0.001)。HD組、MD組、LD組與空白對照組細(xì)胞增殖率分別是(152.06±14.35)、(143.42±8.46)、(118.96±15.68)和(100.32±14.46)：高劑量組、中劑量組與空白對照組比較，具有顯著性差異(P<0.05)；高、中劑量組之間比較無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果提示GLP可促進(jìn)OB的增殖。 (2)礦化結(jié)節(jié)數(shù)：各組礦化結(jié)節(jié)數(shù)的總體比較具有顯著性差異(F=315.247P<0.0

10、01)。HD組、MD組、LD組與空白對照組的礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量(個(gè))分別是(201.604±1.25)、(181.10±6.76)、(118.02±8.97)和(86.97±6.17)LD組、HD組、MD組與空白對照組比較升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高、中劑量組之間差異無顯著性(P>0.05)。 (3)real time PCR測定OPG和RANKL的基因表達(dá)：各組OPG mRNA表達(dá)的總體比較具有顯著性差異(F=100.9

11、71 P<0.001)，L組、M組、H組的OPG mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)水平，分別為(1.84±0.19)、(3.61±0.5)、(4.14±0.51)，與空白對照組(1.01±0.14)比較，M組和H組結(jié)果有顯著性差異(p<0.01)；各組RANKLmRNA表達(dá)的總體比較具有顯著性差異(F=161.360 P<0.001)，L組、M組、H組RANKL mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)水平，分別是(0.89±0.05)、(0.48±0.06)、(0.23

12、±0.03)，其中M組、H組與空白對照組(1±0.09)比較，結(jié)果有顯著差異(P<0.01)。各組OPG/RANKL比例的總體比較具有顯著性差異(F=26.282P<0.001)，與空白對照組比較，L組、M組、H組的OPG/RANKL比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。(4)對p38和磷酸化p38的檢測：Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，各組p38總蛋白表達(dá)的比較無顯著性差異(F=0.117 P>0.05)，而各組磷酸化p38蛋白

13、表達(dá)的比較有顯著性差異(F=63.715 P<0.001)，且L組、M組、H組磷酸化p38與空白組比較明顯增加。 2．經(jīng)SB203580干預(yù)作用后OB各指標(biāo)變化如下： (1)細(xì)胞增殖率：各組細(xì)胞增殖率的總體比較具有顯著性差異(F=7.971P<0.010)。SB組、SB+GLP組與空白組對照比較，增值率分別是(99.12±15.16)、(100.8±16.6)、(100±14)，三者結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。而S

14、B+GLP組與HD組比較，HD組細(xì)胞增殖率為(136.78±16.49)，兩者有顯著性差異(P<0.05)。 (2)礦化結(jié)節(jié)數(shù)目：各組礦化結(jié)節(jié)數(shù)的總體比較具有顯著性差異(F=79.638 P<0.001)。SB組、SB+GLP組與空白組對照比較，礦化結(jié)節(jié)數(shù)為(70.67±6.1)、(78±14.5)、(78.33±9.5)，結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。而SB+GLP組與HD組比較，HD組礦化結(jié)節(jié)數(shù)為(168±17.1)，兩

15、者有顯著性差異(P<0.01)。 (3)real time PCR測定OB的OPG mRNA表達(dá)：各組OPG mRNA的總體比較具有顯著性差異(F=112.374 P<0.001)。SB組、SB+GLP組與空白組對照比較，OPGmRNA為(0.96±0.11)、(1.07±0.08)、(1+0.11)，結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。而SB+GLP組與HD組比較，HD組OPGmRNA為(2.93±0.42)，兩者有顯著性差異(

16、P<0.01)。 (4)real time PCR測定OB的RANKLmRNA表達(dá)：各組RANKL mRNA的總體比較具有顯著性差異(F=38.333 P<0.001)。SB組、SB+GLP組與空白組對照比較，RANKLmRNA為(0.93±0.11)、(1.03±0.09)、(1±0.11)，結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。而SB+GLP組與HD組比較，HD組RANKLmRNA為(0.51+0.09)，兩者有顯著性差異(

17、P<0.01)。OPG/RANKL比例各組總體比較有顯著性差異(F=56.028 P<0.001)，B組、SB+GLP組與空白組RANKLmRNA對照比較，結(jié)果無顯著性差異(P=0.999>0.05、P=1.000>0.05)，而SB+GLP組與HD組比較，HD組OPG/RANKL比例較高，兩組結(jié)果有顯著性差異(P=0.004<0.01)。(5)對p38和磷酸化p38的影響：各組p38總蛋白的總體比較無顯著性差異(F=0.360 P>0