MICA基因多態(tài)性與NK殺傷乳腺癌細(xì)胞的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:探討MICA基因多態(tài)性與乳腺癌細(xì)胞對(duì)NK殺傷敏感度的關(guān)系。
　　方法:1.RT-PCR擴(kuò)增乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S、SK-BR-3的MICA基因,分別克隆入pMD18-T載體,DNA測(cè)序分析。2.構(gòu)建MICA不同等位基因真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,westernblot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MICA的表達(dá)。3.分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,用“IL-2+IL-12+IL-15+IL-18

2、”細(xì)胞因子組合定向擴(kuò)增NK細(xì)胞,再用VarioMACS系統(tǒng)分選純化NK細(xì)胞。4.LDH法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)MICA等位基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的殺傷活性,Elispot法檢測(cè)MICA等位基因轉(zhuǎn)染293T后誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌穿孔素(perforin,PFN)、顆粒酶B(granzymB,GzmB)的能力。
　　結(jié)果:1.測(cè)序結(jié)果顯示:MCF-7細(xì)胞表達(dá)MICA*008/A5.1和MICA*001/A4,MDA-MB-435S細(xì)胞表達(dá)MICA*

3、010/A5,MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞均表達(dá)MICA*019/A5和MICA*002/A9;蛋白序列分析比對(duì)發(fā)現(xiàn):MICA*019/A5和MICA*010/A5僅在蛋白N端第29位氨基酸有差異,分別為精氨酸(Arginine,Arg)和脯氨酸(proline,Pro)。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該Arg或Pro位點(diǎn)在蛋白結(jié)構(gòu)的一個(gè)beta折疊上,而且是處于偏中間的位置。2.將MICA等位基因MICA*008/A5.1、MICA*001

4、/A4、MICA*019/A5、MICA*002/A9、MICA*010/A5分別克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A載體(重組載體分別命名為pMCFA5.1、pMCFA4、p231A5R、p231A9、p435A5P),重組載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,westernblot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示:pMCFA5.1組表達(dá)最低,其次是p435A5P組,而pMCFA4組與p231A5R組、p231A9組表達(dá)較高;流式檢測(cè)細(xì)胞膜表

5、面目的蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示:p435A5P組表達(dá)最低,其次是pMCFA5.1組和MICA*001/A4組,而p231A5R組和p231A9組表達(dá)較高。3.外周血單個(gè)核細(xì)胞定向擴(kuò)增NK細(xì)胞,培養(yǎng)17天后,NK細(xì)胞(CD3-CD56+)比例可達(dá)(72.1±2.9)％,NKG2D達(dá)(93.7±3.6)%;分選后NK細(xì)胞純度可達(dá)(95.2±3.0)%,NKG2D達(dá)(98.1±1.5)%。4.LDH檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了MICA基因的293T細(xì)胞對(duì)

6、NK細(xì)胞殺傷的敏感性明顯升高(P<0.05);在MICA轉(zhuǎn)染的293T中,p435A5P組對(duì)NK殺傷的敏感性最低(P<0.05);而pMCFA5.1、pMCFA4、p231A5R、p231A9各組之間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Elispot檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了各種MICA基因的293T細(xì)胞能明顯誘導(dǎo)NK細(xì)胞釋放穿孔素和顆粒酶B(P<0.05);在MICA轉(zhuǎn)染的293T中,p435A5P組誘導(dǎo)NK細(xì)胞釋放穿孔素和顆粒酶B的能力最低