Hedgehog-Gli1信號通路在膠質(zhì)瘤化療耐受及血管新生過程中作用的試驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分，Hedgehog/Glil信號通路在膠質(zhì)瘤化療耐受中作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究Hedgehog/Glil信號通路在膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)過程中的作用.并就其影響膠質(zhì)瘤化療效果的機(jī)制進(jìn)行初步的探討。
　　方法:
　　(1)收集來自30例膠質(zhì)痛病人第一次手術(shù)及復(fù)發(fā)后第一次手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本60份.采用免疫組化法分析SHH及Glil蛋白的表達(dá)。
　　(2)通過WesternBlot.分析U87、SHG44、U25

2、1及A172四個膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中Hedgehog/Glil信號通路的活化程度。
　　(3)以胞外配體SHH活化Hedgehog/Glil信號通路.采用克隆生存試驗(yàn).檢測這一信號通路活化程度提高后.VCR、VPl6、CDDP及ACNU對A172及U251細(xì)胞殺傷作用的變化。
　　(4)以胞外抑制劑Cyclopamine下調(diào)Hedgehog/Glil信號通路的活化程度.觀察這一信號通路的活化程度下調(diào)后.VCR、VPl6、CDDP及

3、ACNU對U87、SHG44、U251及A172細(xì)胞生存率及早期凋亡的影響。
　　(5)構(gòu)建以Glil基因?yàn)榘邢虻腖V-shGlil.同時(shí)構(gòu)建LV-control作為陰性對照.LV-shGlil及LV-contro1分別轉(zhuǎn)染U87、SHG44及U251細(xì)胞.采用FACS及WesternBlot分析Hedgehog/Glil信號通路活化程度的變化。
　　(6)使用Cyclopamine及Glil水平的RNAi.下調(diào)U87、SH

4、G44及U251細(xì)胞Hedgehog/Glil信號通路的活化程度后.檢測MDRl、MRPl、LRP、MGMT、Bcl-2、Survivin等耐藥相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化。
　　(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SPSSl6.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.兩組間均數(shù)的比較采用t險(xiǎn)驗(yàn).多組間均數(shù)的比較采用方差分析.樣本率間的差別采用卡方檢驗(yàn).以P＜O.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)30例膠質(zhì)瘤病人中.23例病人的組

5、織樣本具有Glil的表達(dá).7例病人的組織樣本無Glil的表達(dá)。具有Glil表達(dá)的這23例膠質(zhì)瘤病人中.復(fù)發(fā)的組織樣本(n=23)均具有Glil的表達(dá).而相應(yīng)的原發(fā)組織樣本中3份無Glil的表達(dá).其余的20份樣本具有Glil的表達(dá).復(fù)發(fā)組(n=23)Glil的陽性細(xì)胞百分比為48.9±20.3％.相應(yīng)原發(fā)組(n=23)的Glil陽性細(xì)胞百分比為34.4％±19.8％.二者相比具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。以SHH染色對上述60份組

6、織樣本進(jìn)行分組.SHH陽性組含42份組織樣本.38/42(90.5％)的標(biāo)本伴有Glil的陽性;而SHH陰性組含18份組織樣本.僅有5/18(27.8％)的標(biāo)本中有Glil的表達(dá).統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組間Glil陽性的樣本數(shù)也有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.01)。
　　(2)WesternBlot結(jié)果顯示.U87、SHG44、U251及A172四個膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均具有Hedgehog/Glil信號通路的活化.在U87及SHG44中這一信號通路

7、活化的程度較高.U251中這一信號通路的活化程度中等.而A172中這一信號通路的活化程度最低。
　　(3)以胞外配體SHH活化U251及A172細(xì)胞中Hedgehog/Glil信號通路.隨著該信號通路活化程度的提高.SHH組腫瘤細(xì)胞較對照組腫瘤細(xì)胞.對VCR、VPl6、CDDP及ACNU的耐受性明顯增強(qiáng).SHH組腫瘤細(xì)胞的克隆存活率顯著增加(P＜O.O1)。
　　(4)Cyclopamine濃度依賴性的方式.下調(diào)U87、SH

8、G44及U251細(xì)胞中Hedgehog/Glil信號通路的活化程度.而且隨著這一信號通路活化程度的降低.Cyclopamine組.VCR、VPl6、CDDP及ACNU引起的腫瘤細(xì)胞生長抑制及早期凋亡.較對照組明顯增加(p＜0.01或P＜0.05).但在A172細(xì)胞中卻沒有上述現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)。
　　(5)U87、SHG44、U251細(xì)胞中.Smo水平Cyclopamine的抑制及Glil水平的RNAi均可引起Hedgehog/Glil信號

9、通路的活化程度顯著地降低.而且隨著這一信號通路活化程度的下降.MDR1、MRP1、LRP、MGMT、BcL-2.Survivin等耐藥相關(guān)基因表達(dá)的也明顯的下調(diào)。
　　(1)在部分膠質(zhì)瘤中存在著異?；罨腍edgehog/Glil信號通路.這一信號通路的過度活化與膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān).SHH在這一信號通路的活化過程中發(fā)揮了重要作用。
　　(2)}Hedgehog/Gli1信號通路活化程度增加.促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受

10、.而該信號通路活化程度的抑制則導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的增加。
　　(3)膠質(zhì)瘤中Hedgehog/Glil信號通路與MDR1、MRP1、LRP、MGMT、BcL-2、Survivin等一系列耐藥相關(guān)基因的表達(dá)存在一定的相關(guān)性。抑制Hedgehog/Glil信號通路的活性.可相應(yīng)的下調(diào)MDR1、MRP1、LRP、MGMT、Bcl-2、Survivin等耐藥相關(guān)基因的表達(dá)。
　　(4)干預(yù)膠質(zhì)瘤中Hedgehog/Glil

11、信號通路的活性.可能代表了一種化療增敏、提高療效的治療措施。
　　第二部分，Hedgehog/Glil信號通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤血管新生相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討膠質(zhì)瘤中異常活化的Hedgehog/Glil信號通路與血管新生的相關(guān)性.以及這一信號通路對VEGF、MMP2及MMP9表達(dá)的調(diào)控作用。
　　方法:
　　(1)采用第一部分的組織樣本60份.通過免疫組化分析CD34的表達(dá).探討Glil的表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)

12、的相關(guān)性。
　　(2)采用SHH活化Hedgehog/Glil信號通路.觀察該信號通路活化后對VEGF、MMP2及MMP9表達(dá)的影響。
　　(3)采用Cyclopamine抑制Hedgehog/Glil信號通路.觀察這一信號通路的活化程度的下調(diào)后.是否伴有VEGF、MMP2及MMP9表達(dá)的降低。
　　(4)在Glil的水平進(jìn)行RNAi.觀察Hedgehog/Glil信號通路被阻斷后.VEGF、MMP2及MMP9表達(dá)的變

13、化。
　　結(jié)果:
　　(1)Glil陽性組(n=43)MVD為27.4±4.6.顯著高于Glil陰性組(n=17)的20.9±3.5.組間的MVD差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.OO1)。
　　(2)Glil低表達(dá)組的MVD為23.7±3.5.中度表達(dá)組的MVD為27.3±3.4.高度表達(dá)組的MVD為33.2±2.9.各組間MVD具有顯著的差異(p＜0.01).而且Glil的陽性程度與MVD呈正相關(guān)(r=0.756.

14、P＜0.01)。
　　(3)Hedgehog/Glil信號通路活化程度上調(diào)后.活化組VEGF、MMP2及MMP9mRNA及蛋白的表達(dá)較對照組明顯增高。
　　(4)Cyclopamine抑制Hedgehog/Glil信號通路后.抑制組VEGF、MMP2及MMP9mRNA及蛋白的表達(dá)較對照組明顯降低.同時(shí)Cyclopamine的抑制作用還具有濃度依賴的特性。
　　(5)Glil水平的RNAi證實(shí).阻斷Hedgehog/Gl

15、il信號通路.對VEGF、MMP2及MMP9mRNA及蛋白的表達(dá)具有明顯的下調(diào)作用。
　　結(jié)論:
　　(1)Hedgehog/Glil信號通路與膠質(zhì)瘤的血管新生存在著一定的相關(guān)性。
　　(2)Hedgehog/Glil信號通路活化程度的提高.可上調(diào)VEGF、MMP2及MMP9表達(dá);反之.則導(dǎo)致VEGF、MMP2及MMP9表達(dá)的降低。
　　(3)抑制Hedgehog/Glil信號通路的活化程度.進(jìn)而下調(diào)VEGF、M