逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)反義端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的影響.pdf

1、目的：研究逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的反義端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的抑制作用，探討通過(guò)抑制端粒酶活性治療肝細(xì)胞癌的有效途徑。 方法：常規(guī)方法進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取質(zhì)粒的濃度和純度，并通過(guò)電穿孔法將攜帶正義和反義端粒酶RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入PT67包裝細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定產(chǎn)病毒細(xì)胞株，分別命名為PT67-hTR～EooRI和PT67-hTR-BamHI：待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集逆轉(zhuǎn)錄病毒

2、上清，超速離心獲得濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒，采用NIH3T3細(xì)胞檢測(cè)所收集逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度：用濃縮后的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HepG2肝癌細(xì)胞，G418篩選4周獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的肝癌細(xì)胞克隆，分別命名為HepG2-hTR-EcoRI和HepG2-hTR-BamHI;挑取單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，利用擴(kuò)增端粒酶RNA基因的引物進(jìn)行PCR鑒定：通過(guò)MTT法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染正義和反義端粒酶RNA基因組肝癌細(xì)胞(HepG2-hTR～EcDRI和HepG2-hTR-B

3、amHI)以及未轉(zhuǎn)染端粒酶RNA基因組肝癌細(xì)胞(HepG2)的生長(zhǎng)曲線，并分析反義端粒酶RNA基因與化療藥物(5-氟尿嘧啶和順鉑)對(duì)于肝癌細(xì)胞的協(xié)同抑制作用：免疫熒光化學(xué)檢測(cè)不同處理組肝癌細(xì)胞抗中性粒細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況；TRAP-PCR-ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞的端粒酶活性：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞所處的細(xì)胞周期及凋亡率的改變。 結(jié)果：PCR鑒定可于約500 bp處檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，證明基因轉(zhuǎn)染成功：所收集的濃縮逆轉(zhuǎn)

4、錄病毒滴度分別為0.95×10<'6>CFU/ml和1.1×10<'6>CFU/ml：反義端粒酶RNA基因治療組肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，生長(zhǎng)曲線較為平緩，細(xì)胞對(duì)順鉑(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)分別為1.53μg/ml和3.41μg/ml，而對(duì)照組的半數(shù)抑制濃度分別為2.83μg/ml和6.44μg/ml，兩者差別明顯：轉(zhuǎn)染反義端粒酶RNA基因組細(xì)胞的抗中性粒細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)表達(dá)減少：

5、端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示試驗(yàn)組細(xì)胞的吸光密度值為(2.31±0.16)，較作為對(duì)照的轉(zhuǎn)染正義端粒酶RNA基因的HepG2-hTR-EcoRI組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染端粒酶RNA基因的HepG2組細(xì)胞明顯下降(P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果示試驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率為(9.58±1.38)﹪，與對(duì)照組相比差別具有顯著性(P<0.01)，且試驗(yàn)組肝癌細(xì)胞可見(jiàn)G<,2>/M期阻滯及凋亡峰。 結(jié)論：端粒酶RNA(hTR)是端粒酶活性的一個(gè)重要組成部分