徐長(zhǎng)卿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG-2凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:觀察徐長(zhǎng)卿體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系HepG-2細(xì)胞凋亡，初步探討徐長(zhǎng)卿的分子作用機(jī)制，為徐長(zhǎng)卿治療肝癌尋找實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:采用細(xì)胞藥理學(xué)方法研究徐長(zhǎng)卿HepG-2細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)調(diào)控基因等指標(biāo)的影響。主要觀察指標(biāo)及方法如下： 1.徐長(zhǎng)卿對(duì)HepG-2細(xì)胞的毒性作用實(shí)驗(yàn)： 用0.06％胰蛋白酶將HepG-2細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)液制成濃度為3×10<'5>個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，按0.1ml/孔接種于

2、96孔板，置37℃、飽和濕度、5％CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁2d后換含藥培養(yǎng)液0.01ml/孔，每個(gè)濃度3孔。將徐長(zhǎng)卿水提物原液作系列倍比稀釋成以八個(gè)濃度：50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39g/L；將徐長(zhǎng)卿醇提物原液作系列倍比稀釋成以下七個(gè)濃度50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g/L，置37℃、飽和濕度、5％CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)不加藥物的對(duì)照；12d后

3、去掉上清，所余細(xì)胞用MTT法測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞毒性。 2.徐長(zhǎng)卿對(duì)HepG-2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞數(shù)為1×lO<'4>/ml的細(xì)胞懸液，在24孔培養(yǎng)板中接種，每孔1ml。細(xì)胞貼壁后，加入含徐長(zhǎng)卿水提物濃度為22g/L和11g/L和徐長(zhǎng)卿醇提物稀濃度為11g/和5.5g/L的維持培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、2、3、4、5、6、7天，各取樣4孔，消化細(xì)胞

4、后加入臺(tái)盼蘭染液計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并與培養(yǎng)時(shí)間作圖。 3.徐長(zhǎng)卿水提物對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞周期的影響： 處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后制成均勻細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。當(dāng)活細(xì)胞率大于95％，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。①將細(xì)胞懸液用完全培養(yǎng)基稀釋至10<'6>/ml，接種于50cm<'2>培養(yǎng)瓶中，每瓶5ml，于37℃，5％CO<,2>、飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)，然后進(jìn)行處理。②藥物組，培養(yǎng)液中加入徐長(zhǎng)卿水提物終濃度為22g/L、11g/

5、L，同時(shí)做正常細(xì)胞對(duì)照。作用時(shí)間為48小時(shí)，每組3瓶。DNA染色：棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用。Hanks液洗2遍，0.06％胰酶消化3分鐘，輕輕吹打成細(xì)胞懸液，300g離心5分鐘，去上清，將細(xì)胞重懸于1ml冷乙醇中，并輕輕吹打，4℃固定，固定時(shí)間大于24小時(shí)。固定后離心，300rpm，5分鐘，去上清，加入50 μg/ml的RNA酶1ml，輕輕吹打，室溫避光30分鐘，除去細(xì)胞內(nèi)RNA。然后300 rpm，5分鐘再離心，去上清，加入60μg/ml的

6、PI 1ml，輕輕吹打，室溫避光30分鐘。FACS檢測(cè)：樣品最后上機(jī)進(jìn)行FACS檢測(cè)。用ModFit軟件分析，統(tǒng)計(jì)出各時(shí)相細(xì)胞的百分比。 4.徐長(zhǎng)卿提取物對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞凋亡的影響： 4.1 DNA梯度電泳(DNA Ladder)觀察DNA降解片段：DNA提?。核幬锝M和正常細(xì)胞組的細(xì)胞在培養(yǎng)48hr后，常規(guī)抽提DNA。 檢測(cè)方法：運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA Ladder． 結(jié)果判斷：正常活細(xì)胞DN

7、A顯基因組條帶位于加樣孔附近，壞死細(xì)胞由于其DNA的不規(guī)則降解顯一條連續(xù)的膜狀條帶，凋亡細(xì)胞的DNA則因?yàn)镈NA降解為180bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段顯“梯狀(1adder)"條帶。 4.2 流式細(xì)胞術(shù)觀察徐長(zhǎng)卿提取物對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞凋亡的影響： HepG-2細(xì)胞的培養(yǎng)及處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.06％胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液O.4％臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算活細(xì)胞率為97.5％。將細(xì)胞懸液接種至50cm<'2>培

8、養(yǎng)瓶中，10<'6>個(gè)細(xì)胞/瓶，在37℃，5％Co<,2>、飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，加入含藥培養(yǎng)基。藥物組：每瓶培養(yǎng)液5ml中加入徐長(zhǎng)卿水提物終濃度為22g/L、11g/L；對(duì)照組加入等量2％DMEM。加藥后于24小時(shí)、48小時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取3瓶細(xì)胞，進(jìn)行檢測(cè)。凋亡細(xì)胞的檢測(cè)：小心棄掉培養(yǎng)液，0.06％胰酶消化3分鐘，輕輕吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，1000r/min離心10分鐘，Bindihg Buffer重懸細(xì)胞至l×10<'6>/

9、ml，取100ul細(xì)胞懸液至5ml FACS管中，加入5 μl Annexin V-FITC，10μl F混勻，室溫下避光孵育15分鐘后每管加入400ul BindirBuffer，1小時(shí)內(nèi)上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。同時(shí)染對(duì)照管(主細(xì)胞)和補(bǔ)償設(shè)置管，即未染色的細(xì)胞，單染Annexin V-FIT的管和單染PI的管FCM流式細(xì)胞術(shù)分析：采用ALTRA型流式細(xì)胞儀，488nm激發(fā)光源。先將對(duì)照管上樣，通過調(diào)整參數(shù)FSC和SSC，在散射光點(diǎn)圖(

10、FSC/SSC)中清獲顯示出一個(gè)清晰、集中的細(xì)胞群體，對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行設(shè)門(Gate)，再以門中細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)熒光信號(hào)檢測(cè)。將對(duì)照管(裸細(xì)胞)的熒光強(qiáng)度設(shè)定為非特異性本底熒光，并在此基礎(chǔ)上確定陽(yáng)性熒光表達(dá)比率。調(diào)定流式細(xì)胞儀，使熒光散入圖中裸細(xì)胞集中分布在左下象限。保持FLl、FL2、FL3不變分別將單染AV-FITC的管和單染PI的管上樣，調(diào)整儀器熒光補(bǔ)償值，進(jìn)行光譜重疊校正后即可分析樣本。每個(gè)樣本上獲取10，000個(gè)細(xì)胞，采用CellQ