色氨酸飼料對中華絨螯蟹生長性能的影響及其機理的初步分析.pdf

1、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），俗稱河蟹。因其營養(yǎng)價值高，味道鮮美，受到廣大消費者的喜愛，是我國的名特優(yōu)水產(chǎn)品。近年來中華絨螯蟹養(yǎng)殖朝著集約化、規(guī)?；粩喟l(fā)展，提高中華絨螯蟹的生長性能、降低早熟率等一直以來就是人關(guān)注的焦點。色氨酸作為一種必需氨基酸，其代謝會產(chǎn)生如5-HT等多種活性物質(zhì)，它們與動物體生長、發(fā)育、攝食、行為等諸多方面密切相關(guān)。研究表明飼料中添加色氨酸可提高一些動物的生長性能，提高成活率，促進采食和降低攻

2、擊行為等。而之前的免疫組化分析表明5-HT受體在中華絨螯蟹腸道等組織中廣泛分布，暗示了色氨酸和5-HT在中華絨螯蟹體內(nèi)有諸多生理作用；浸泡和注射實驗表明5-HT可一定程度上促進中華絨螯蟹的蛻殼，縮短食物在腸道內(nèi)的運行時間。本文使用不同色氨酸含量的飼料對中華絨螯蟹進行了30d的投喂，發(fā)現(xiàn)色氨酸飼料一方面提高中華絨螯蟹的成活率并降低斷肢率，另一方面可提高攝食量，肝胰腺中蛋白酶、脂肪酶活性也升高了，后續(xù)使用高清攝像頭攝像實驗表明色氨酸飼料提高

3、了中華絨螯蟹的攝食率和攝食過程中的運動時間。這說明色氨酸確實對中華絨螯蟹的攝食有促進作用，這與其他動物的一些研究相似。本實驗還發(fā)現(xiàn)色氨酸可以促進中華絨螯蟹的蛻殼，為了深入研究，第三章選取調(diào)控蛻殼的主要器官—Y-器官在正常和性早熟兩種情況下進行了轉(zhuǎn)錄組分析。色氨酸的代謝產(chǎn)生的5-HT是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。其發(fā)揮作用是通過介導(dǎo)相應(yīng)的受體實現(xiàn)的，中華絨螯蟹5-HT基因克隆方面進展緩慢，無法從分析功能等角度更深入的研究色氨酸和5-HT對中華絨螯

4、蟹的生理作用，所以第四章利用第三章轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對5-HT1B受體基因進行了克隆，現(xiàn)得到了3’端和5’端部分片段，并通過熒光定量的方法對5-HT1B受體在各組織和不同色氨酸飼料投喂后四種組織的表達情況進行了分析，為后續(xù)更深入的研究提供了資料。具體結(jié)果如下：
　　1）本研究首先用不同色氨酸含量的飼料對中華絨螯蟹進行投喂，實驗周期為30d。旨在探討飼料中添加色氨酸對幼蟹生長性能的影響。試驗選取初始體重為2.45g左右的幼蟹360尾，隨機分

5、成4組，每組3個重復(fù)，在室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)分別投喂各自的色氨酸飼料。各組分別投喂色氨酸含量為0.36％（A,對照組)、0.47%(B)、0.73%(C)、和1.05%(D)色氨酸的4種飼料。記錄實驗前后體重、體長、體寬、體高，以及斷肢和蛻殼情況，每隔7d測量各組攝食量。30d時解剖采集各組中華絨螯蟹肝胰腺用于蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的測定。結(jié)果表明：各組中華絨螯蟹體重、體長、體寬和體高增加率以及肝體比均無顯著差異（P＞0.05）。D組的存活

6、率與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。C組的斷肢率最低，與A組相比差異顯著（P＜0.05）。C組的蛻殼率和蛻殼前期的比例顯著高于A組和B組。第7d時，B組和D組的攝食量顯著高于A組；第21d時，D組攝食量顯著高于B組。飼料中添加色氨酸可提高中華絨螯蟹存活率、蛻殼率和攝食量，并降低斷肢率。
　　2）隨后測量各組消化酶活性，結(jié)果表明：各試驗組肝胰腺淀粉酶活性無顯著性差異。脂肪酶活性C組最高，顯著高于A組（P＜0.05），但B組和D組

7、與A組相比無顯著性差異（P＞0.05）。而B組的蛋白酶活性均顯著高于A組、C組和D組（P＜0.05）。由此可見，飼料中添加色氨酸可提高脂肪酶活性和蛋白酶活性。
　　3）色氨酸是5-HT和褪黑激素等生理活性物質(zhì)的前體，可以促進動物采食，降低日糧優(yōu)質(zhì)蛋白用量，削弱打斗行為，提高成活率。本部分旨在研究色氨酸水平對中華絨螯蟹攝食過程中運動時間和攝食率的影響，以期探索幼蟹飼料中適宜的色氨酸水平，并為色氨酸在此過程中生理調(diào)節(jié)作用的深入研究奠定

8、基礎(chǔ)。試驗采用單因素4水平實驗設(shè)計。將60只體重為14.27±1.29g的1齡幼蟹隨機分成4組，每組15只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，色氨酸水平為0.36%（A，control)。其余三組添加不同劑量的L-色氨酸，飼料中實測含量分別為：0.47%(B)、0.73%(C)、和1.05%(D)。將幼蟹單只暫養(yǎng)于規(guī)格為35×25×10cm聚乙烯水箱中7d后，試驗期間8點分別投喂1g左右的飼料。使用高清攝像頭記錄中華絨螯蟹在喂食1h內(nèi)的運動時間以此計

9、算中華絨螯蟹在攝食過程中的運動時間比例；并在1h后用200目的紗網(wǎng)收集殘餌以計算攝食率；用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明：B組和C組飼料組明顯增加了中華絨螯蟹在攝食過程中的運動時間。此兩實驗組蟹在攝食過程中的運動時間比例分別為30.36±13.27%和32.26±14.50%，與對照組17.13±8.48%的運動時間相比差異顯著(P＜0.05)，D組為24.04±11.98%與對照組間差異不顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，L-色氨酸能提高中華絨螯

10、蟹的攝食率，其中C組和D組組攝食率分別為5.7±1.16%和5.52±1.03%，明顯高于對照組（4.46±0.68%），且兩組間存在差異顯著(P＜0.05)。結(jié)論：L-色氨酸參與了中華絨螯蟹攝食運動和攝食過程，且有促進作用。綜合考慮，飼料中色氨酸的含量為0.75%時比較合適。
　　4）本研究采用Illumina Hiseq2000高通量測序技術(shù)對正常與性早熟雌蟹Y-器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了比較分析，以期挖掘Y器官中差異基因的代謝通路

11、和5-HT受體基因信息，并為探究性早熟基因水平的原因提供資料。測序分別獲得44619538和43052958個clean reads，比對發(fā)現(xiàn)2655個差異表達基因，Gene Ontology（GO）功能分類分析將文庫中的差異表達基因歸類到3大功能（生物過程、細胞組分和分子功能）的42個類別中。KEGG富集分析，將文庫中的差異表達基因富集到134條特定的KEGG代謝途徑，其中4條是顯著性富集，包括酮體合成和降解、丁酸甲酯代謝、神經(jīng)營養(yǎng)因

12、子信號通路和堿基切除修復(fù)通路。通過RNA-seq技術(shù)獲得了豐富的中華絨螯蟹Y-器官轉(zhuǎn)錄組信息，為中華絨螯蟹新基因克隆、性早熟成因與預(yù)防和Y-器官的研究提供有價值的數(shù)據(jù)?；谵D(zhuǎn)錄組分析，獲得了大量5-HT受體序列信息，比對數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)這些序列為1A、1B、1D、2A、2B、2C、7等類型，可作為后續(xù)RACE實驗的核心片段。
　　5）基于轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，進行了后序基因克隆的研究。獲得了5-HT1B受體的主要序列，此后分析了此基因在不同組

13、織中的表達情況以及在色氨酸飼料投喂后其在不同組織中的表達情況進行分析。根據(jù)正常與性早熟中華絨螯蟹的Y-器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計了5HT1B受體的引物：5HT1F和5HT1R擴增得到從而得到核心片段。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和cDNA末端快速擴增（RACE）技術(shù)，得到了中華絨鰲蟹5HT1B受體基因部分片段。測序結(jié)果表明擴增到的中華絨螯蟹5HT1B受體片段長為1732bp，其中開放閱讀框長1080bp,編碼359個氨基酸。經(jīng)BLA

14、STp分析顯示，中華絨螯蟹5HT1B受體片段與北黃道蟹(Cancer borealis)和美洲海螯蝦(Homarus americanus)的5-HT1B受體同源性高達96%和86%。并通過熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)研究了5HT1B受體基因在中華絨螯蟹的不同組織表達情況，結(jié)果顯示上述兩者基因在肝、肌肉、卵巢、血、腸道、鰓、胸神經(jīng)、Y-器官、腦神經(jīng)和眼柄10個組織中均有表達，并且均在肝胰腺中高水平表達，同其他組織表達量差異顯著（