CD200及microRNA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、第一部分：
　　 CD200信號缺陷在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制中的作用
　　 背景和目的：
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種可累及多個臟器組織的自身免疫性疾病，吞噬功能障礙使得凋亡細(xì)胞不能及時被清除以致大量自身抗原釋放誘發(fā)自身免疫被認(rèn)為是疾病啟動的重要環(huán)節(jié)，CD4+CD25high FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg

2、s)，作為維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和免疫耐受的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)組分，在SLE患者中存在數(shù)量和/或質(zhì)量上的缺陷，參與了SLE疾病的發(fā)生發(fā)展。CD200是Ⅰ型跨膜糖蛋白，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答閾值和細(xì)胞因子產(chǎn)生極向，參與免疫穩(wěn)態(tài)的維持。本研究旨在評估系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中CD200/CD200R1的表達(dá)和功能狀態(tài)。諸多證據(jù)顯示CD200/CD200R1在實驗性自身免疫性疾病中具有重要作用，這一信號通路在人類的自身免疫性疾病如SLE中的作用仍不明確，本研究旨

3、在探討SLE患者中CD200/CD200R1信號的表達(dá)和功能異常。
　　 研究方法：
　　 明確診斷為SLE的初治患者161人，同期選取年齡性別匹配的健康對照95人，采集抗凝外周靜脈血無菌分離單個核細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測各細(xì)胞亞群表面CD200和CD200R1的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清游離CD200水平。 Western Blot檢測CD4+T細(xì)胞中DOK2表達(dá)和p-DOK2的水平。通過體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察

4、CD200信號對Th17細(xì)胞分化及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)生成的影響。 CFSE染色測定CD200信號對體外刺激培養(yǎng)細(xì)胞增殖的影響。 Annexin V/propidium iodide染色測定CD200對細(xì)胞凋亡的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)分選出CD200+的活細(xì)胞，CD200-的活細(xì)胞，CD200+的早期凋亡細(xì)胞， CD200-的早期凋亡細(xì)胞，并將這幾組細(xì)胞與體外誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞共孵育。通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)分析樹突狀細(xì)胞與各組細(xì)胞的

5、結(jié)合及吞噬情況。通過transwell遷移分析測定游離CD200對樹突細(xì)胞趨化的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1．SLE患者PBMC中CD200+細(xì)胞比例顯著高于健康對照(p=0.026)，尤以CD4+T細(xì)胞(p=0.012)、 CDllc-CD123high漿樣樹突細(xì)胞(pDC)(p=0.004)和CDllc+CD123-髓樣樹突細(xì)胞(mDC)(p=0.016)為著，而CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD38high曲

6、漿細(xì)胞及CD14+單核細(xì)胞無此趨勢(p＞0.05)。
　　 2．CD3+CD200+細(xì)胞比例與血清C3水平負(fù)相關(guān)(r=-0.486，p＜0.05)。
　　 3．SLE患者血清中CD200水平也顯著高于健康對照(p＜0.0001)，且血清CD200的水平與血清C3水平負(fù)相關(guān)（r=-0.45，p=0.014），但與SLEDAI評分、血清中BAFF、IL-6、IFN-α、anti-dsDNA不相關(guān)(p＞0.05)。
　　

7、 4．SLE患者PBMC中CD200R1+細(xì)胞比例顯著低于健康對照(p=0.001)，尤以CD4+T細(xì)胞(p=0.004)、pDC(p＜0.001)和mDC(p＜0.001)中為著。不論是在SLE患者還是在健康對照，CD4+CD45RA'純真T細(xì)胞中CD200R1的表達(dá)均顯著低于CD4+CD45RO+記憶T細(xì)胞(p＜0.05)，而SLE患者與健康對照之間并無差異。
　　 5．CD200Fc可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞DOK2磷酸化。<

8、br>　　 6．抗CD200R1抗體可促進(jìn)TCR活化驅(qū)動的SLE患者CD4+T細(xì)胞增殖。
　　 7．CD200信號減少CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。
　　 8．CD200信號可糾正SLE患者CD4+CD25higf FoxP3+ Treg細(xì)胞的生成缺陷。
　　 9．SLE患者凋亡淋巴細(xì)胞增加并伴有CD200上調(diào)。
　　 10.早期凋亡細(xì)胞中CD200的表達(dá)與DC結(jié)合吞噬能力下降有關(guān)。
　　

9、11. CD200Fc抑制DC遷移。
　　 結(jié)論：
　　 我們證實在SLE患者中CD200+細(xì)胞和血清CD200水平顯著增高，而CD200R1水平顯著下降，以CD4+T細(xì)胞和DCs尤為顯著。SLE患者中，CD200Fc可減少Th17細(xì)胞比例并糾正CD4+CD25hghFoxP3+ Treg的誘導(dǎo)缺陷。而抗CD200R1抗體可促進(jìn)抗CD3/抗CD28刺激的CD4+T細(xì)胞增殖。此外，我們發(fā)現(xiàn)SLE患者早期凋亡細(xì)胞的CD200

10、表達(dá)上調(diào)并可抑制DCs對其結(jié)合和吞噬的能力。以上數(shù)據(jù)說明SLE患者存在CD200和CD200R1的表達(dá)和功能異常，并參與了其免疫紊亂的發(fā)生。
　　 第二部分：
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者microRNA-7的表達(dá)及功能
　　 背景和目的：
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病，B細(xì)胞的異常增殖活化是SLE的特征之一。小RNA

11、(microRNAs，miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類單鏈非編碼小RNA，成熟miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA表達(dá)，miRNAs在進(jìn)化中高度保守。近年多項研究證明，miRNAs參與生物體的生長、發(fā)育、衰老、凋亡的調(diào)控及遺傳背景的穩(wěn)定，并與人類疾病相關(guān)。在本實驗室的前期工作中初步發(fā)現(xiàn)SLE的發(fā)病與mir-7的異常表達(dá)相關(guān)。目前對mir-7的研究主要在腫瘤方面，然而，mir-7在自身免疫病特別是SLE的發(fā)病中的作用尚無研究。本研究就

12、mir-7在SLE患者中的表達(dá)及功能進(jìn)行了探討。
　　 研究方法：
　　 明確診斷為SLE的初治患者20人，同期選取年齡性別匹配的健康對照20人，采集抗凝外周靜脈血無菌分離單個核細(xì)胞。
　　 熒光定量PCR法（Taqman探針法）檢測SLE患者及HC外周血中PBMC、B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞中mir-7的表達(dá)。
　　 應(yīng)用生物信息學(xué)方法及雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)預(yù)測并驗證mir-7的靶基因。利用流式細(xì)胞或者

13、磁珠從外周血PBMC中分選出B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞。熒光定量PCR法（染料法）檢測SLE患者及HC外周血中B細(xì)胞、T細(xì)胞中類脂磷酸酶PTEN(phosphatase and tensin homologdeleted onchromosome ten)的mRNA水平。
　　 通過電轉(zhuǎn)染分別轉(zhuǎn)染pre-mir-7、anti-mir-7或control-microrna到3組外周血B細(xì)胞，使B細(xì)胞中mir-7過表達(dá)或抑制表達(dá)后，熒

14、光定量PCR法（染料法）檢測PTEN的mRNA水平，CFSE染色轉(zhuǎn)染后的B細(xì)胞，刺激培養(yǎng)5天后檢測B細(xì)胞的增殖功能。
　　 通過腺病毒轉(zhuǎn)染Ad-mir-7及對照Ad-GFP到外周血PBMC,48小時后流式細(xì)胞儀檢測CD200R1蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．檢測初治SLE患者和正常對照PBMC中mir-7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SLE患者mir-7的表達(dá)顯著高于HC，具有統(tǒng)計學(xué)差異(0.86±0.03 vs0.1

15、0±0.08，p=0.0001)。SLE患者B細(xì)胞中mir-7的表達(dá)顯著高于HC，具有統(tǒng)計學(xué)差異(0.59±0.08 vs0.31±0.06，p=0.027)，然而SLE患者T細(xì)胞及單核細(xì)胞中mir-7的表達(dá)與HC無統(tǒng)計學(xué)差異(0.91±0.18 vs0.99±0.18, p=0.78,1.30±0.36 vs0.98±0.02, p=0.70)，所以mi R-7表達(dá)量的差異主要集中在B細(xì)。
　　 2．通過生物信息學(xué)方法預(yù)測mi

16、R-7的靶基因，挑選與SLE發(fā)病可能相關(guān)的8個靶基因( PTEN、F0X01、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB)．采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證，各組熒光素酶活性均下降（P＜0.05），說明miR-7可以通過與PTEN、FOX01、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB的3’ UTR區(qū)相互作用發(fā)揮功能
　　 3．比較初治SLE患者及HC的T、B細(xì)胞中P

17、TEN mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在SLE患者B細(xì)胞中表達(dá)較HC下調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)差異(0.92±0.24 vs2.20±0.49，p=0.041)，在T細(xì)胞中的表達(dá)與HC相比無明顯差異(1.23±0.24 vs1.55±0.53，p=0.579)。
　　 4．通過電轉(zhuǎn)染的方法，分別轉(zhuǎn)染pre-mir-7、anti-mir-7、control microrna至外周血B細(xì)胞中，結(jié)果顯示該方法能夠在B細(xì)胞中有效過表達(dá)或抑制表達(dá)mir-7。

18、
　　 5．在B細(xì)胞中過表達(dá)或抑制表達(dá)mir-7后， PTEN的mRNA水平相應(yīng)下調(diào)或上調(diào)，B細(xì)胞增殖功能相應(yīng)增強(qiáng)或減弱，說明在人的B細(xì)胞中，mir-7能夠直接抑制PTEN的表達(dá)水平，并能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖。
　　 6．在PBMC中轉(zhuǎn)染Ad-mir-7或Ad-GFP，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Ad-GFP48小時后CD200R1的陽性率為25.13％，平均熒光強(qiáng)度MFI=406.55，轉(zhuǎn)染Ad- mir-748小時后CD200R1的陽性

19、率為7.51%，平均熒光強(qiáng)度MFI=262.86，說明mir-7能夠直接下調(diào)CD200R1的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：
　　 SLE患者外周血PBMC中mir-7的表達(dá)較健康對照上調(diào)，主要集中在B細(xì)胞中，并且在SLE患者外周血B細(xì)胞中，PTEN mRNA的表達(dá)較健康對照減少，通過生物信息學(xué)預(yù)測方法、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證方法以及體外直接轉(zhuǎn)染的方法，均證明PTEN是mir-7的靶基因，在B細(xì)胞中過表達(dá)或抑制表達(dá)mir-7