免疫球蛋白C在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)及RNA干擾IGHG1基因表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　 前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是威脅男性健康的常見腫瘤之一。在美國(guó)，PCa的發(fā)病率占男性惡性腫瘤的第1位，死亡率是11％，僅次于肺癌，列在腫瘤性死亡的第2位[1]。2004年美國(guó)大約有230，110例新發(fā)PCa，有29，900例死于此病。在全球范圍，PCa的發(fā)病率占男性惡性腫瘤的第3位[2]。在歐洲，每年得到確診的新發(fā)PCa病例大約有260萬人，PCa占全部男性癌癥人數(shù)的11％，占全部男

2、性癌癥死亡人數(shù)的9％[3]。近年隨著人口老齡化及生活條件的改善，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率有明顯增加的趨勢(shì)，逐年增加，1997年發(fā)病率約2.0人/10萬男性人口，至2000年為4.55人/10萬男性人口，在男性泌尿、生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率躍居第三位[4]。
　　 但是迄今為止，前列腺癌的發(fā)病機(jī)制并未研究明晰，且前列腺癌的臨床癥狀不典型，病情隱匿，臨床上大約有1/3的患者在診斷時(shí)已經(jīng)存在局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，已失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，而采用

3、以去勢(shì)治療為基礎(chǔ)的內(nèi)分泌治療，其療效常常不佳，該類患者的中位緩解時(shí)間18～20個(gè)月，對(duì)內(nèi)分泌治療失去療效，最終所有病人都將進(jìn)展為雄激素非依賴性前列腺癌和（或）激素難治性前列腺癌[5-9]。目前，對(duì)于中、晚期前列腺癌的治療仍是個(gè)難題，如何有效地治療激素非依賴性前列腺癌或激素難治性前列腺癌依然是研究的難點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者都在探求基因水平的調(diào)控方法和新靶點(diǎn)，因此，尋找有效的分子靶向治療手段一直是近幾年來前列腺癌治療的熱點(diǎn)[10，11]。

4、>　　 經(jīng)典的免疫學(xué)理論認(rèn)為，免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是B淋巴細(xì)胞的特征性產(chǎn)物，其他的體細(xì)胞不會(huì)表達(dá)Ig。但近年來的多位學(xué)者研究證實(shí)上皮來源惡性腫瘤如:乳腺癌、惡性黑色素瘤、肺癌和消化道腫瘤等及軟組織肉瘤均有Ig樣物質(zhì)表達(dá)，其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并進(jìn)一步證實(shí)在這些惡性腫瘤細(xì)胞中存在Ig基因的轉(zhuǎn)錄[12，13]。Golda等觀察到前列腺癌患者體內(nèi)血清IgG的濃度通常升高[14]。另Babbage等研究發(fā)現(xiàn)

5、乳腺癌細(xì)胞分泌的IgG可激活誘導(dǎo)型二磷膽堿脫氨酶活性，具有進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)生異常突變的能力[15]。許多研究表明，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，Ig發(fā)揮著重要作用。Zheng等[16]不僅證明許多非造血性細(xì)胞表達(dá)Ig，且進(jìn)一步證實(shí)在人類上皮來源的癌細(xì)胞中，免疫球蛋白的基因轉(zhuǎn)錄物有著VDJ重組特征。國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)包括IgG在內(nèi)的癌細(xì)胞源性Ig能夠抑制效應(yīng)Ig分子介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，對(duì)上皮性腫瘤細(xì)胞的增殖能力有一定的

6、促進(jìn)作用。已經(jīng)證實(shí)Ig的高表達(dá)與腫瘤臨床分期、病理分級(jí)呈正相關(guān)，可作為評(píng)判肉瘤預(yù)后的指標(biāo)之一[13,17]。通過抗人IgG抗體或用反義寡脫氧核苷酸封閉腫瘤來源的IgG活性，具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、降低IgG表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制人上皮來源的腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，這使其可成為腫瘤的分子靶向治療提供潛在的靶點(diǎn)。
　　 前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展與人體內(nèi)雄激素密切相關(guān)，但其確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。有研究表明由上皮來源的腫瘤

7、患者體內(nèi)血清IgG、IgA或IgM抗體的濃度通常升高，這些腫瘤包括有乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肝癌和前列腺癌。但是對(duì)于檢測(cè)Ig在前列腺癌中表達(dá)及功能研究，鮮見報(bào)道。國(guó)內(nèi)外尚缺少雄激素倚賴型前列腺癌細(xì)胞株表達(dá)Ig，以及癌細(xì)胞從雄激素依賴型向雄激素非依賴型轉(zhuǎn)化后表達(dá)Ig有無變化的相關(guān)研究。目前對(duì)癌細(xì)胞表達(dá)的Ig在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)化時(shí)所起的正性推動(dòng)作用的判斷是否也適用于前列腺癌？阻止Ig表達(dá)或?qū)笽g能否促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡？由此設(shè)想，如能證

8、明在不同類型的前列腺癌細(xì)胞株可表達(dá)IgG，進(jìn)一步研究針對(duì)IgG的分子靶向治療的效果，可能為前列腺癌癌變機(jī)制提供新的線索，也將為中、晚期前列腺癌的生物治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)和研究方向。
　　 鑒于目前激素非依賴性前列腺癌和難治性前列腺癌對(duì)內(nèi)分泌治療、放療及化療等各種治療均不敏感，患者中位存活時(shí)間短，積極尋找有效的分子靶向治療手段成為當(dāng)下研究的重點(diǎn)。陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的前列腺特異性膜抗原(PSMA)、黏蛋白-1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4

9、(CTLA-4)等腫瘤相關(guān)抗原，為前列腺癌的免疫治療提供了新的思路。根據(jù)藥物作用的細(xì)胞信號(hào)靶點(diǎn)，近年來PCa分子靶向治療主要著眼于:抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、蛋白激酶抑制、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGRF)信號(hào)通路靶向抑制、內(nèi)皮素信號(hào)通路拮抗等[18-22]。由于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的、多因素交叉對(duì)話的蛋白網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，大多數(shù)實(shí)體腫瘤都是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的調(diào)控過程。處于不同分化階段的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性，使得單一途徑的靶向治療往往

10、不足以遏制腫瘤進(jìn)展?？紤]到傳統(tǒng)雄激素阻斷療法的單靶點(diǎn)性，今后腫瘤治療和藥物研發(fā)的方向?qū)?huì)轉(zhuǎn)向多靶點(diǎn)聯(lián)合阻斷;致力于深入研究誘發(fā)激素難治性前列腺癌的最關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，找出最敏感且特異性最高的治療靶點(diǎn);找出能預(yù)測(cè)前列腺癌預(yù)后和有激素難治性前列腺癌傾向的最敏感的指標(biāo)，并設(shè)計(jì)出合理的檢測(cè)方法，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早治療的目的。
　　 RNA干擾(RNAinterfernce，RNAi)是近期發(fā)展起來的一種新的基因治療和診斷技術(shù)，RNA干擾是

11、指利用小RNA（包括小干擾RNA即siRNA）序列抑制特定基因信號(hào)的過程。將具有特定序列的siRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，可引起同源序列mRNA的特異性降解，來高效特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)特定基因缺失的表型，從而達(dá)到某些實(shí)驗(yàn)或治療目的，并廣泛應(yīng)用于腫瘤的基因治療[23]，近年來，RNAi技術(shù)的發(fā)展為前列腺癌治療的研究提供了一種新思路，我們?cè)O(shè)想通過RNA干涉的方法，抑制IgG的表達(dá)，誘導(dǎo)非激素依賴性前列腺癌細(xì)胞的凋亡，以探討對(duì)非

12、激素依賴性前列腺癌細(xì)胞的基因治療。
　　 目的:
　　 (1)體外培養(yǎng)前列腺癌兩種不同類型細(xì)胞株LNCaP、PC-3表達(dá)IgG的強(qiáng)度和部位，揭示PCa細(xì)胞表達(dá)Ig的基本特點(diǎn)。
　　 (2)通過對(duì)良性前列腺增生組織和前列腺癌組織表達(dá)IgG強(qiáng)弱的觀察，探討IgG在前列腺癌組織中的表達(dá)意義及與前列腺癌病理分級(jí)的相關(guān)性，初步明確IgG在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的可能關(guān)系，并探索IgG能否作為判斷前列腺組織惡性度的指標(biāo)。

13、　　 (3)構(gòu)建并篩選出最有效的siRNA，RNA干擾PC3細(xì)胞IGHG1基因的表達(dá)，研究其對(duì)PC3細(xì)胞生物學(xué)行為如生長(zhǎng)增殖、凋亡等的影響，為以IGHG1基因?yàn)榘悬c(diǎn)治療前列腺癌尋找有效的治療策略;并初步探討沉默后誘導(dǎo)PC3細(xì)胞調(diào)亡的機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)通過培養(yǎng)LNCaP和PC3兩種不同類型前列腺癌細(xì)胞株，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)LNCaP和PC3細(xì)胞的IgG表達(dá)情況，進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Weste

14、rnblot檢測(cè)LNCaP和PC3細(xì)胞IgG1mRNA和IgG蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　 (2)收集南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科前列腺癌根治手術(shù)標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)采用Envision兩步染色法檢測(cè)前列腺癌和前列腺增生癥組織中IgG的表達(dá)。
　　 (3)根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并化學(xué)合成siRNA序列，篩選抑制效率最高的siRNA，復(fù)蘇培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將抑制效率最高的IGHG1-siRNA轉(zhuǎn)

15、染入前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3中，觀察轉(zhuǎn)染效果，設(shè)轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組三組;并通過熒光定量PCR和westernblot實(shí)驗(yàn)觀察其下調(diào)IGHG1在人前列腺癌PC3細(xì)胞中表達(dá)的效率，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后3個(gè)組IgG1-mRNA和IgG蛋白的表達(dá)變化。
　　 (4)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡的情況;MTS法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組人前列腺癌PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;并通過熒光定量PCR和Westernblot的方法檢測(cè)下調(diào)IGHG1

16、表達(dá)后Caspase3蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)流式細(xì)胞儀檢測(cè)LNCaP和PC3細(xì)胞株的細(xì)胞膜表面及胞漿內(nèi)均有IgG的表達(dá)，LNCaP細(xì)胞胞膜及胞漿IgG陽性表達(dá)率為2.96％和89.22％;PC3細(xì)胞IgG陽性表達(dá)率為86.73％和90.99％。進(jìn)一步通過熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)LNCaP和PC3細(xì)胞的IgG1-mRNA和IgG蛋白的相對(duì)表達(dá)量。LNCaP細(xì)胞IgG1-mRNA相對(duì)表

17、達(dá)量為1±0.37，PC3細(xì)胞IgG1-mRNA相對(duì)表達(dá)量為3.08±0.15，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=0.295，P=0.001。Westernblot檢測(cè)PC3和LNCaP細(xì)胞的IgG蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.92±0.15，1.05±0.86，兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=0.238，P=0.001。
　　 (2)免疫組化示前列腺癌細(xì)胞染色呈不均一性，陽性反應(yīng)主要位于胞漿。前列腺癌組織中IgG蛋白陽性表達(dá)率為91.

18、1％(41/45)，而對(duì)照前列腺增生組織中IgG蛋白的陽性表達(dá)為12.5％(5/40)。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=49.585，P=0.000)。前列腺癌組織中IgG蛋白表達(dá)強(qiáng)度與患者年齡、PSA無關(guān)，P＞0.05，與Gleason評(píng)分病理分級(jí)呈正相關(guān)，rs=0.403，P=0.006，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)轉(zhuǎn)染后，IGHG1-siRNA轉(zhuǎn)染組的IgG1mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.28±0.43，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照

19、組相的相對(duì)表達(dá)量分別為8.82±1.33、8.07±1.78;Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組IgG蛋白水平上的表達(dá)變化，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量分別為2.85±0.24和3.01±0.16，而siRNA轉(zhuǎn)染組IgG蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.24±0.11，轉(zhuǎn)染組的IgG1mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均有明顯降低，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組兩組相比較沒有顯著變化（P＞0.05）。

20、>　　 (4)MTS法證實(shí)沉默IGHG1表達(dá)之后，在轉(zhuǎn)染后48對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制效應(yīng)，抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001，轉(zhuǎn)染后對(duì)PC3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用隨時(shí)間變化呈線性趨勢(shì)，48和72小時(shí)的抑制率為31.3％、43.3％。各組PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率為5.29％±0.41％，促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，空白對(duì)照組調(diào)亡率為1.49％±0.29％和陰性對(duì)照組的調(diào)亡

21、率為1.92％±0.17％，轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (5)siRNA轉(zhuǎn)染48h后，利用熒光定量PCR檢測(cè)siRNA干擾組的caspase-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量為3.93±0.28，陰性對(duì)照與空白對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量分別為2.51±0.43，2.47±0.36;經(jīng)單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染干擾組與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

22、(P=0.004)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。通過westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.92±0.12和1.06±0.14，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而siRNA轉(zhuǎn)染組caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.34±0.11，顯著高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P=0.014)。

23、　　 結(jié)論:
　　 (1)IgG在LNCaP和PC3細(xì)胞均有表達(dá)，PC3細(xì)胞中高表達(dá)，提示其與前列腺癌的惡性程度密切相關(guān)。
　　 (2)IgG在前列腺癌組織中高表達(dá)，與Gleason分級(jí)呈正相關(guān)，與前列腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并可作為前列腺癌預(yù)后的評(píng)判指標(biāo)。
　　 (3)靶向IGHG1基因的RNAi可明顯抑制PC3中IgG基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。靶向沉默PC3細(xì)胞中IGHG1基因的表達(dá)后，可明顯