番茄鈣調(diào)蛋白和類鈣調(diào)蛋白的抗病調(diào)控功能分析.pdf

1、鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)是廣泛存在于真核生物中的非常重要的一類鈣離子結(jié)合蛋白，是Ca2+最重要的受體。CaM在真核生物中高度保守，在部分動物物種中的進化關(guān)系已有報道，但是對其在植物中的進化關(guān)系還不明確。此外，CaM在植物的生長發(fā)育和抗逆抗病過程中起重要的調(diào)控作用。但是它在包括番茄在內(nèi)的許多重要作物中的抗病調(diào)控功能及其機制還不明確。本論文主要圍繞CaM在植物中的進化關(guān)系及其在番茄中的抗病調(diào)控作用展開研究，揭示了植物中普遍存

2、在的多個CaM基因編碼同一CaM蛋白的現(xiàn)象，解析了CaM在植物中的進化關(guān)系，明確了CaM對番茄抗病性的重要調(diào)控功能及部分機理。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、爬蒙镄畔W方法在基因組水平鑒定獲得了來自5個遺傳譜系（雙子葉植物，單子葉植物，蕨類植物，苔蘚類植物及藻類植物）的37個植物物種的150條CaM序列，明確了CaM在植物中的進化關(guān)系。對150條CaM基因及其翻譯成的蛋白序列的比較分析顯示，植物中150條CaM基因僅編碼了44個C

3、aM蛋白，來自同一物種甚至多個不同科的多個CaM基因編碼同一CaM蛋白。該現(xiàn)象在植物中普遍存在。44個CaM蛋白均為包含4個EF-hand基序的長度為149個氨基酸的蛋白。其中13個CaM蛋白在Ca2+結(jié)合位點發(fā)生氨基酸替換。其中，藻類植物Ostreococcus lucimarinus的Pro33-OlCaM1、苔蘚植物Physcomitrellapatens的Pro34、蕨類植物S.moellendorffii的Pro27-SmCa

4、M2、本氏煙Pro5-NbCaM7、番木瓜（Carica papaya）Pro6-CpCaM12以及野草莓（Fragariavesca）Pro43-FvCaM2發(fā)生非相似氨基酸替換。這6個蛋白的Ca2+結(jié)合活性有待生物學實驗驗證。構(gòu)建的CaM蛋白系統(tǒng)進化樹顯示，CaM蛋白序列聚成三個組(GroupⅠ-Ⅲ)。GroupⅠ僅包含高等植物CaM，GroupⅡ僅包含低等苔蘚類和蕨類植物CaM，而GroupⅢ包括來自低等藻類和苔蘚植物CaM以及高

5、等陸生雙子葉植物的CaM?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，GroupⅠ和GroupⅡ中所有植物CaM基因均含1個內(nèi)含子，GroupⅢa CaM基因不含內(nèi)含子，而GroupⅢb CaM基因含3個相位譜為1-0-0的內(nèi)含子。因此，GroupⅢb CaM可能是最新進化出的一類新型CaM。此外，GroupⅢb CaM蛋白第60位甘氨酸(G)由谷氨酰胺(Q)替代，是否影響其功能有待分析。
　?、泼鞔_了番茄等植物CaM基因的抗病調(diào)控功能。分析了來自2個

6、不同科的碧桃和本氏煙不同類型CaM基因?qū)Ω黝愔参锊≡锏捻憫?yīng)表達情況。結(jié)果表明，碧桃CaM基因?qū)μ铱s葉病菌（Taphrina deformans）、本氏煙CaM和CML基因?qū)?類病原菌水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)、番茄葉斑病菌Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000(Pst DC3000)以及作物菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum

7、呈現(xiàn)不同的響應(yīng)表達模式，可能行使不同調(diào)控功能。SlCaM3和SlCaM5基因的VIGS沉默導致煙草脆裂病毒(TRV)的大量積累，并表現(xiàn)嚴重的病毒癥狀;顯著減弱植物對核盤菌的抗性;SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的沉默降低了番茄植株對瓜果腐霉（Pyhium aphanidermatum）的抗性;而SlCaM3和SlCML的瞬時表達增強了本氏煙對核盤菌的抗性。這些結(jié)果表明，SlCaM3和SlCaM5在植株對TRV病毒、核盤菌和瓜

8、果腐霉的抗性中起正調(diào)控作用，SlCaM4在植株對瓜果腐霉的抗性中起正調(diào)控作用，而SlCML在植物對核盤菌的抗性中起正調(diào)控作用。
　　⑶明確了CaM基因的抗病調(diào)控機理。Real-time PCR基因表達檢測結(jié)果顯示， SlCaM3和SlCaM5基因的沉默強烈下調(diào)PR1和PR5基因的表達。SlCaM3和SlCML基因的過表達下調(diào)Ca2+通路基因CNGC17、CNGC18和CAMTA3的表達。酵母雙雜交分析結(jié)果表明，SlCaM能與4個S

9、lCAMTA(SlCAMTA3/5/6/7)及5個SlCNGC(SlCNGC5/15/16/17/18)互作，而SlCAMTA3和SlCNGC16/17/18對番茄核盤菌等的抗病性起負調(diào)控作用。因此，SlCaM可能通過與SlCAMTA和SlCNGC等靶蛋白的直接互作并抑制這些負調(diào)控性靶蛋白的功能來提高植物的抗病性。另外，利用原核表達和親和色譜蛋白純化技術(shù)純化獲得了SlCaM6蛋白。2.5μM濃度的SlCaM6蛋白液浸潤導致茄科本氏煙和十