Treg細(xì)胞和IL-18在腦膠質(zhì)瘤中的作用研究.pdf

1、目的：腦膠質(zhì)瘤，尤其是高級(jí)別膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，腫瘤呈浸潤性生長，手術(shù)很難將其全部切除，盡管結(jié)合放化療等綜合治療，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍十分不理想，復(fù)發(fā)率高，高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間甚至不足1年。隨著分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展，膠質(zhì)瘤的免疫治療逐步得到人們的重視。
　　 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性與其復(fù)雜的病理生理學(xué)特點(diǎn)有關(guān)，其逃逸免疫監(jiān)視能力限制了機(jī)體產(chǎn)生有效抗腫瘤免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞，

2、Treg)在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過程中扮演重要角色。Treg細(xì)胞具有免疫抑制作用，對(duì)維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。Treg細(xì)胞在抑制效應(yīng)性T細(xì)胞功能的同時(shí)，也降低機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，間接促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長。在多種惡性腫瘤組織中（如乳腺癌，卵巢癌，肺癌，肝癌，惡性淋巴瘤等）有大量Treg細(xì)胞浸潤，其在患者外周血淋巴細(xì)胞中的比例也明顯升高。并且，Treg細(xì)胞的數(shù)量與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，清除Treg細(xì)胞或抑制其功能有助于機(jī)體抗腫瘤

3、免疫功能的恢復(fù)。
　　 Treg細(xì)胞分為天然型和誘導(dǎo)型，前者由胸腺產(chǎn)生，后者可在外周由非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。在腫瘤微環(huán)境中，異常增多的Treg細(xì)胞也分為兩類，一種是在腫瘤細(xì)胞趨化下，由外周遷徙而來，一種是在腫瘤局部特定環(huán)境中由非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。浸潤在腫瘤中的Treg細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞作用下分化成熟，具有腫瘤特異性，可阻止效應(yīng)性T細(xì)胞（主要是CD8+和CD4+T細(xì)胞）的功能。在腫瘤局部，Treg細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞在數(shù)量上的不平

4、衡是引起腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要因素。因此打破這種不平衡成為腫瘤免疫治療新的策略。
　　 白細(xì)胞介素18(IL-18)作為前炎因子，常高表達(dá)在多種自身免疫疾病組織及體液中，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、紅斑狼瘡等。在這些患者體內(nèi)，Treg細(xì)胞明顯減少，而效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞功能由于失去Treg細(xì)胞的抑制作用而明顯上調(diào)，導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生。IL-18的高表達(dá)應(yīng)與Treg細(xì)胞的減少存在某種關(guān)聯(lián)。此外，IL-18本身也具有明顯抗腫瘤功能

5、，包括誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的細(xì)胞毒性，促進(jìn)活化的CD4+T細(xì)胞分化成為輔助性T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞。在腫瘤動(dòng)物模型研究及臨床試驗(yàn)中，IL-18已被證實(shí)具有抗腫瘤功能，但在腫瘤微環(huán)境中是否能夠逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞的免疫抑制作用，尚缺乏研究報(bào)道。本研究旨在探討Treg細(xì)胞在腦膠質(zhì)瘤組織中的數(shù)量與腫瘤發(fā)展的關(guān)系，探討其免疫抑制性功能的機(jī)制，以及IL-18對(duì)Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：

6、　　 1.收集2007年9月至2009年9月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院神經(jīng)外科治療的腦膠質(zhì)瘤患者的外周血及腫瘤組織標(biāo)本，共76例。同期因腦疝行腦內(nèi)減壓術(shù)獲得的正常腦組織標(biāo)本及健康人群外周血標(biāo)本作為陰性對(duì)照。
　　 分離腫瘤組織及正常腦組織中浸潤淋巴細(xì)胞及患者、健康對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測組織中及外周血中Treg細(xì)胞、CD4+TCD8+T細(xì)胞的含量及比率，分析其與腦膠質(zhì)瘤患者臨床、病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。
　

7、　 采用ELISA法測定腦膠質(zhì)瘤患者外周血中TGF-β1的含量。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)定量檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3mRNA的含量，分析兩者表達(dá)的關(guān)系。
　　 2.收集2008年9月至2009年9月間在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院神經(jīng)外科治療的5例腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織標(biāo)本。采集同期健康志愿者外周血標(biāo)本及行腦內(nèi)減壓術(shù)獲得正常腦組織為對(duì)照。
　　 分別培養(yǎng)正常人腦星形膠質(zhì)原代細(xì)胞及原代膠質(zhì)瘤

8、細(xì)胞，采用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行鑒定。膠質(zhì)瘤組織體外原代培養(yǎng)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞體外原代培養(yǎng)均獲成功，并經(jīng)免疫組化染色鑒定、證實(shí)。分離組織中浸潤淋巴細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞后，采用Mini MACS免疫磁珠分離技術(shù)獲得組織和外周血中CD4+CD25+、CD4+CD25-及CD8+T細(xì)胞。經(jīng)免疫磁珠兩次分選后，CD4+CD25+T細(xì)胞的純度達(dá)89～92％，CD4+CD25-T細(xì)胞純度在90％以上，CD8+T細(xì)胞純度達(dá)87％～94％。按照不同比

9、例將CD4+CD25+T和CD4+CD25-T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞共同培養(yǎng)，采用[3H]-TdR摻入法檢測CD4+CD25+T對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞增殖的影響。
　　 采用Western Blot法對(duì)不同來源的CD4+CD25+T細(xì)胞中Foxp3、CTLA-4、GITR、CCR4和CCR8蛋白進(jìn)行定量檢測。采用ELISA法對(duì)膠質(zhì)瘤組織原代培養(yǎng)細(xì)胞及不同來源CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1、CCL

10、12和CCL22進(jìn)行定量檢測。
　　 3.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LXSN，將插入IL-18基因的質(zhì)粒感染PA317包裝細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后獲得表達(dá)IL-18分子的PA317陽性細(xì)胞克隆，用IL-18/PA317培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)染9L細(xì)胞，篩選出高表達(dá)IL-18的IL-18/9L細(xì)胞克隆，傳代培養(yǎng)。
　　 將雄性F344大鼠隨機(jī)分為2組，每組15只，分別顱內(nèi)接種9L細(xì)胞和IL-18/9L細(xì)胞，每組分別在顱內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞后7天、14

11、天、21天時(shí)各處死3只大鼠，每組剩余的6只大鼠用于觀察生存期。
　　 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)定量檢測各組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織中IL-18mRNA的表達(dá)。在顱內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞21天時(shí)，采用[3H]-TdR摻入法檢測各組大鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)情況，ELISA法檢測各組大鼠脾細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生情況。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組膠質(zhì)瘤組織中Treg細(xì)胞、CD4+T、CD8+T細(xì)胞的含量及比率，分析其與大鼠膠質(zhì)瘤生長及生存期的關(guān)系。

12、取接種9L細(xì)胞21天時(shí)的大鼠腫瘤組織，分離腫瘤組織中浸潤淋巴細(xì)胞，利用Mini MACS免疫磁珠分離系統(tǒng)，分選CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞，將兩者共同培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入IL-18，觀察CD4+CD25+T細(xì)胞免疫抑制功能的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例變化：流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T

13、細(xì)胞的含量為10.41±2.13％，明顯高于健康人外周血（4.35±1.07％）(p＜0.01)。腦膠質(zhì)瘤組織中Treg細(xì)胞比例為35.45±2.47％，明顯高于健康對(duì)照腦組織（Treg細(xì)胞含量2.53±0.75％）。膠質(zhì)瘤組織中浸潤的Treg細(xì)胞含量與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位無關(guān)。不同病理學(xué)級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中CD8+T細(xì)胞比例無明顯差別（p＞0.05）。
　　 膠質(zhì)瘤患者TIL或PBMC中Tre

14、g細(xì)胞比例變化：將膠質(zhì)瘤患者TIL中Treg細(xì)胞所占比例的均值(M)作為閾值，分為高比值組(＞M)和低比值組＜M)，繪制兩組的生存曲線，應(yīng)用log-rank法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，Treg細(xì)胞比例與患者預(yù)后無明顯關(guān)聯(lián)，高比值組患者的生存期與低比值組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。而CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織的浸潤數(shù)量亦與患者預(yù)后無關(guān)(p＞0.05)。而以腫瘤組織中CD8+T/Treg細(xì)胞比值作為觀測指標(biāo)時(shí)，其比值與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后呈正相關(guān)

15、，高比值組患者的生存期明顯長于低比值組，兩者具有顯著差異(p＜0.05)。
　　 膠質(zhì)瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)及TGF-β1含量：膠質(zhì)瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中均可見Foxp3mRNA表達(dá)，明顯高于健康人，并隨膠質(zhì)瘤惡性級(jí)別的增加而升高(p＜0.05)。膠質(zhì)瘤患者外周血中均可檢測到TGF-β1，并隨著腫瘤惡性程度的升高而增加。直線回歸分析顯示，外周血TGF-β1含量與PBMC中Foxp3mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(

16、r=0.940，p＜0.05)。
　　 2.不同來源Treg細(xì)胞F0xp3、CTLA-4、GITR蛋白表達(dá)：Western Blot分析結(jié)果顯示，不同來源的CD4+CD25+T細(xì)胞均檢測到Foxp3、CTLA-4及GITR蛋白表達(dá)，而CD4+CD25-T細(xì)胞無相應(yīng)蛋白表達(dá)。源自膠質(zhì)瘤患者外周血及腫瘤組織中的Treg細(xì)胞，F(xiàn)oxp3表達(dá)明顯高于健康人。而在不同來源CD4+CD25+T細(xì)胞之間，CTLA-4和GITR的表達(dá)并無明顯區(qū)

17、別(p＞0.05)。源自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者TIL中的CD4+CD25+T細(xì)胞高表達(dá)CCR4（0.64±0.21），顯著高于健康者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞的含量（0.27±0.13）(p＜0.05)（Fig2-8），但CCR8在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中和健康者外周血中均未見明顯表達(dá)。
　　 CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)CD4+CD25-T及CD8+T細(xì)胞增殖的影響：在抗人CD3單克隆抗體作用下，將不同比例CD4+CD25+T細(xì)胞和C

18、D4+CD25-T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞共同培養(yǎng)，CD4+CD25+T細(xì)胞可明顯抑制CD4+CD25-T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的增殖。隨著CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量的增加，對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的抑制率逐步升高。
　　 原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞、不同來源CD4+CD25+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的水平：ELISA檢測結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞及不同來源CD4+CD25+T細(xì)胞均分泌TGFβ1，而在正常人腦星形

19、膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中，未檢測到TGF-β1。在來源于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者TIL及PBMC的CD4+CD25+T細(xì)胞中，TGF-β1的分泌量分別為6.21±1.14μg/ml和5.47±1.05Ltg/ml，兩者無明顯差異（p＞0.05），但均明顯高于健康者外周血中的CD4+CD25+T細(xì)胞（2.32±0.61μg/ml）(p＜0.05)。原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞大量分泌CCL22（12.17±1.23μg/ml），明顯高于CCL12（4.68±0.83

20、μg/ml）(p＜0.05)。
　　 3.接種親代鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞9L的F344大鼠腫瘤組織中，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量明顯增多，并呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。
　　 接種IL-18/9L和9L細(xì)胞大鼠腦腫瘤組織中IL-18mRNA表達(dá)：分別取接種IL-18/9L細(xì)胞和9L細(xì)胞21d時(shí)的大鼠腦腫瘤組織，經(jīng)RT-PCR分析，結(jié)果表明：IL-18/9L細(xì)胞組大鼠腦腫瘤組織中有IL-18mRNA表達(dá)，而接種9L細(xì)胞組

21、大鼠腦腫瘤組織中無IL-18mRNA表達(dá)，說明IL-18/9L細(xì)胞在荷瘤大鼠體內(nèi)仍可表達(dá)IL-18。
　　 IL-18對(duì)大鼠脾細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生的影響：接種IL-18/9L細(xì)胞組大鼠脾細(xì)胞可產(chǎn)生高水平IFN-γ（178.2±13.1pg/ml），明顯高于接種9L細(xì)胞組(40.7±5.3pg/ml)(p＜0.01)。
　　 IL-18對(duì)CD4+CD25+T細(xì)胞免疫抑制功能的影響：在不同CD4+CD25+T:CD4+CD25

22、-T細(xì)胞比例下，IL-18均不能影響CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖抑制，與對(duì)照組比較無顯著差異(p＞0.05)。
　　 接種IL-18/9L組大鼠生存期為66.3±5.02d，明顯長于接種9L細(xì)胞組大鼠（43.5±3.87d）(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.膠質(zhì)瘤患者外周血、腫瘤組織中Treg細(xì)胞含量明顯增加。膠質(zhì)瘤組織中CD8+T/Treg細(xì)胞比值與患者的預(yù)后呈正相關(guān)。Tr

23、eg細(xì)胞在膠質(zhì)瘤組織中的比例尚不能單獨(dú)作為患者預(yù)后的指標(biāo)。膠質(zhì)瘤患者外周血中Treg細(xì)胞的數(shù)量與血漿TGF-β1的水平呈正相關(guān)。
　　 2.Treg細(xì)胞在膠質(zhì)瘤中聚集和發(fā)揮免疫抑制作用的可能機(jī)制是：膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過CCL22/CCR4趨化作用，驅(qū)使Treg細(xì)胞由外周向腫瘤部位遷移，并在腫瘤部位通過分泌TGF-β1誘導(dǎo)非Treg細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化和成熟、Treg細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸和分泌抑制性細(xì)胞因子TGF-β1發(fā)揮免疫抑制作