單核-巨噬細(xì)胞TLR4介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)在肝細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞損傷是臨床各類肝臟疾病的最常見病理改變之一，引起肝細(xì)胞損傷的誘發(fā)因素包括病毒感染、酒精和化學(xué)毒性物質(zhì)等，其分子機(jī)制與自由基生成、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、鈣超載以及單核/巨噬細(xì)胞功能狀態(tài)等密切相關(guān)。各類機(jī)制之間相互聯(lián)系、相互促進(jìn)，共同作用引起肝細(xì)胞凋亡、變性及壞死。目前認(rèn)為，肝臟不僅是人體的最大消化腺，也是重要的免疫器官。在肝臟中有大量的免疫細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞等，廣泛參與人體的免疫反應(yīng)，免疫細(xì)胞功能失控必然導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷

2、。機(jī)體的免疫反應(yīng)通?？煞譃樘烊幻庖吆瞳@得性免疫，其中天然免疫是機(jī)體抵御病原入侵的第一道防線，同時能調(diào)節(jié)獲得性免疫的方向和強(qiáng)度。肝組織中的Kupffer細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞均可參與天然免疫，其中Kupffer細(xì)胞數(shù)量巨大，功能最強(qiáng)，是人體單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的重要組成部分。因此，我們以單核/巨噬細(xì)胞為主要研究對象，探討其介導(dǎo)的天然免疫在肝細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制。
　　 本研究共分五個部分，以單核/巨噬細(xì)胞為主要研究對象，通過

3、研究單核/巨噬細(xì)胞的TLR4受體及其信號通路變化，揭示單核/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)在肝細(xì)胞損傷中的作用。
　　 首先，為了研究病毒性肝炎患者內(nèi)毒素血癥及外周血單核細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA的表達(dá)的關(guān)系，我們收集各型病毒性肝炎患者及正常人外周靜脈血，采用鱟試劑法測定血漿脂多糖(LPS)濃度，用RT-PCR法檢測外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：肝炎患者血漿LPS濃度均不同程度的高于對照組，以重型肝炎組升高最顯著(

4、P＜0.05)；重型肝炎組單核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)升高也最明顯(P＜0.05)，而其他各型肝炎與對照組比較差異不明顯(P＞0.05)。提示各型肝炎均存在內(nèi)毒素血癥，以重型肝炎最為嚴(yán)重，且重型肝炎外周血單核細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA的表達(dá)水平最高，可能與肝細(xì)胞損傷相關(guān)。
　　 為了研究在急性肝損傷時肝組織TLR4的表達(dá)變化及其與肝細(xì)胞損傷的關(guān)系，我們用D-Gal/LPS制作大鼠急性肝損傷模型，HE染色觀察肝組織病理變化程度，

5、并于不同時間點檢測肝功能指標(biāo)，免疫組化觀察肝組織TLR4的表達(dá)，TUNEL法觀察肝臟細(xì)胞凋亡情況。同時運(yùn)用NF-κB特異性抑制劑二硫氨基甲酸酞吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)阻斷TLR4的下游信號通路，研究抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對肝損傷的影響。結(jié)果顯示：急性肝損傷模型鼠在4～24h ALT、AST等生化指標(biāo)異常升高，肝組織TLR4表達(dá)增強(qiáng)，凋亡的肝臟細(xì)胞數(shù)隨時間的延長逐漸增多；PDTC干預(yù)后可明顯

6、減輕肝組織病理改變，與模型組相比，TLR4表達(dá)較弱，肝臟細(xì)胞凋亡也顯著減少，提示TLR4可通過激活NF-κB途徑及其下游通路在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　 在肝組織中，Kupffer細(xì)胞表達(dá)的TLR4是結(jié)合LPS的主要受體，但肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)少量的TLR4，為了進(jìn)一步明確Kupffer細(xì)胞表達(dá)的TLR4在急性肝損傷中發(fā)揮的作用，我們在大鼠急性肝損傷模型基礎(chǔ)上，運(yùn)用GdCl3對肝臟Kupffer細(xì)胞有特異抑

7、制作用，通過免疫組化檢測ED1表達(dá)，ED1是Kupffer細(xì)胞特異性分子標(biāo)記蛋白，判斷 GdCl3對Kupffer細(xì)胞的抑制程度，并檢測不同實驗組動物血清ALT、TNFα、IL-1β的水平，Western blot分析肝組織TLR4的表達(dá)。在GdCl3組大鼠的肝組織中觀察到，與對照組相比ED1陽性細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)，其門靜脈血中ALT、TNFα、IL-1β的含量無明顯變化(P＞0.05)。而比較GdCl3＋LPS組與LPS組的

8、肝組織病理改變發(fā)現(xiàn)，GdCl3預(yù)處理明顯減輕了D-Gal/LPS誘導(dǎo)的肝組織病變(肝細(xì)胞變性、壞死)程度，同時抑制了D-Gal/LPS誘導(dǎo)的炎前細(xì)胞因子TNFα、IL-1β升高(P＜0.05)，說明GdCl3抑制了Kupffer細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響肝組織TLR4的表達(dá)，并減少炎前細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而減輕LPS對肝細(xì)胞的損傷。此部分進(jìn)一步證實了Kupffer細(xì)胞及其表達(dá)的TLR4在急性肝損傷中的重要作用。
　　 LPS激活Kupf

9、fer細(xì)胞不僅能誘導(dǎo)其產(chǎn)生IL-1、TNFα等炎前細(xì)胞因子，還可產(chǎn)生大量的趨化因子，募集外周血免疫細(xì)胞進(jìn)入肝組織。Kupffer細(xì)胞是肝臟中唯一表達(dá)、合成5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LO)的細(xì)胞，而5-LO是白三烯類代謝物生成的關(guān)鍵酶，能催化花生四烯酸生成5-羥基廿碳四烯酸 (5-HETE)、白三烯(Leukotrienes，LTs)等物質(zhì)，其中LTs則是中性粒細(xì)胞的最強(qiáng)趨化因子之一。為了研究LPS激活Kupffer

10、細(xì)胞TLR4后，細(xì)胞合成、釋放炎性介質(zhì)的變化，我們用原位酶灌注，密度梯度離心等方法，分離、純化培養(yǎng)原代Kupffer細(xì)胞，LPS刺激后，于12h、24h、48h收集不同實驗組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，硝酸還原酶法測定NO水平，ELISA法檢測TNFα含量，半定量RT-PCR法檢測細(xì)胞5-LO mRNA的表達(dá)。同時觀察了免疫調(diào)制激素-生長抑素(somatostatin，SST)對LPS作用的影響。研究結(jié)果顯示：分離培養(yǎng)的Kupffer細(xì)胞表達(dá)低水平

11、的NO、TNFα和5-LO mRNA。LPS刺激后各時間點NO、TNFα和5-LO mRNA含量均明顯高于對照組(P<0.05)。SST干預(yù)后各時間點NO、TNFα和5-LO mRNA含量低于LPS刺激組(P<0.05)，而NO、TNFα含量在各時間點均高于對照組(P<0.05)，5-LO mRNA表達(dá)在12h、24h時間點高于對照組(P<0.05)，而在48h時間點與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。SST能抑制LPS誘導(dǎo)

12、的Kupffer細(xì)胞NO，TNFα和5-LO mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果提示，LPS可通過TLR4激活Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，而SST則可通過抑制LPS對Kupffer細(xì)胞的作用，使其NO、TNFα和5-LO mRNA的表達(dá)減少，減輕炎性細(xì)胞浸潤，從而發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用。
　　 為了進(jìn)一步研究內(nèi)毒素血癥時，Kupffer細(xì)胞激活對肝細(xì)胞代謝和增殖的直接影響，我們收集了Kupffer細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(Kupffer c

13、ell conditioned medium，KCCM)，作用于分離、培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞，通過檢測肝細(xì)胞培養(yǎng)基ALT、AST、乳酸脫氫酶(LDH)的含量，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測KCCM對原代肝細(xì)胞活性的影響，觀察KCCM對肝細(xì)胞的損傷情況。結(jié)果顯示，KCCM作用于肝細(xì)胞2h后，肝細(xì)胞培養(yǎng)基中ALT、AST及LDH含量均明顯升高(P＜0.05)，在2～24h內(nèi)隨時間延長ALT、AST及LDH含量均逐漸增加，呈明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系；M

14、TT結(jié)果顯示，KCCM作用后12h、24h時間點對肝細(xì)胞具有明顯損傷作用(P＜0.05)。以上結(jié)果提示：LPS誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞釋放的可溶性因子可直接對肝細(xì)胞造成損傷。
　　
　　 小結(jié)：各型肝炎均存在內(nèi)毒素血癥，以重型肝炎最為顯著，且重型肝炎外周血單核細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA的表達(dá)水平最高。Kupffer細(xì)胞及其表達(dá)的TLR4在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。生長抑素能抑制LPS誘導(dǎo)的Kupffer細(xì)胞NO、