大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系線粒體DNA的APLP分析.pdf

1、植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmicmalesterility，CMS)的研究在植物雄性不育研究及雜種優(yōu)勢利用上具有舉足輕重的作用，CMS于1921年首先在亞麻中發(fā)現(xiàn)，目前，在玉米、高粱、水稻、小麥、油菜和向日葵等農(nóng)作物中都發(fā)現(xiàn)了CMS，并在雜種優(yōu)勢利用中發(fā)揮了巨大作用。 大豆是重要的蛋白脂肪兼用作物，產(chǎn)量一直是限制大豆生產(chǎn)的制約因素，雜種大豆可顯著提高單產(chǎn)(13-20％，甚至更高)及抗逆性，因而，應(yīng)用雜種優(yōu)勢是發(fā)展我國大

2、豆生產(chǎn)的重要途徑之一，目前最有希望用于雜種大豆生產(chǎn)的還是雄性不育三系。 Davis(1985，美國)通過栽培大豆與栽培大豆雜交獲得質(zhì)核互作不育系、保持系，但至今未見進(jìn)一步研究報道。孫寰等(1997)育成了栽培不育系并實(shí)現(xiàn)了三系配套，且對其進(jìn)行了精確的遺傳和細(xì)胞遺傳學(xué)研究，大豆質(zhì)核互作不育系研究已經(jīng)進(jìn)入雜種優(yōu)勢利用和昆蟲傳粉制種研究階段。同時國內(nèi)掀起了大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育性研究熱，但到目前為止，有關(guān)質(zhì)核互作不育機(jī)理的分子生物學(xué)研究，

3、國內(nèi)外尚未見報道。 AFLP是1993年由荷蘭科學(xué)家ZABEAU和VOS發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法。其所需DNA量少，不需Southern雜交，并且不象SSR、ISSR那樣需要預(yù)先知道目的基因的序列信息，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性強(qiáng)，呈典型的孟德爾遺傳，每個AFLP反應(yīng)可以檢測的位點(diǎn)多達(dá)50-100個，多態(tài)性很強(qiáng)，非常適合遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、基因定位、快速構(gòu)建遺傳圖譜等研究，應(yīng)用前景廣闊。 本研究以大豆國

4、家工程研究中心趙麗梅研究員提供的獨(dú)特的雜交大豆材料：不育系JLCMS1-1A及其保持系JLCMS1-1B、不育系JLCMS1-2A及其保持系JLCMS1-2B、不育系JLCMS1-3A及其保持系JLCMS1-3B為試驗(yàn)試材，應(yīng)用AFLP方法對大豆線粒體DNA進(jìn)行標(biāo)記分析，以期標(biāo)記到極有可能與大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育密切相關(guān)的線粒體DNA片段，為后續(xù)尋找大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因及在指導(dǎo)育種生產(chǎn)上發(fā)揮作用奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：1通過反復(fù)試驗(yàn)，摸索

5、出適用于大豆線粒體DNA提純的方法，所提純的線粒體DNA純度高，適于AFLP等的試驗(yàn)研究；2對JLCMS1-2BNADH進(jìn)行測序分析，通過NADH基因同源性分析得到相關(guān)物種親緣關(guān)系進(jìn)化樹狀圖；3運(yùn)用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)的方法，對獨(dú)特的雜交大豆試材進(jìn)行分析研究，通過比較MseⅠ-HindⅢ、MseⅠ-PstⅠ、MseⅠ-EcoRⅠ不同酶切組合的效果，結(jié)果表明MseⅠ-HindⅢ較容易找到多態(tài)性引物組合，而且具有較高的多態(tài)性，本試

6、驗(yàn)選用MseⅠ-HindⅢ進(jìn)行雙酶切大豆線粒體DNA從而完成AFLP的分析工作，試驗(yàn)用64對MseⅠ和HindⅢ引物對兩個不育系及保持系材料的線粒體DNA制成的pool進(jìn)行AFLP標(biāo)記分析，分析了不育系與保持系之間的多態(tài)性；4經(jīng)過初步篩選，選出10對能揭示出大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系線粒體DNA多態(tài)性的引物組合，多態(tài)性出現(xiàn)率達(dá)30％；5經(jīng)統(tǒng)計(jì)，用這10對引物共擴(kuò)增條帶2127條，其中多態(tài)性條帶607條，充分證明了擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(A

7、FLP)方法所得的多態(tài)性極高。同時標(biāo)記到可能與雄性不育相關(guān)的特異性條帶(只在不育系中擴(kuò)增出來，而在保持系中沒有擴(kuò)增出來的帶)有7條，為后續(xù)對大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的標(biāo)記研究奠定基礎(chǔ)；6本研究建立了運(yùn)用AFLP方法對大豆線粒體DNA進(jìn)行分析研究的完整體系，包括：模板制備，AFLP的酶切、連接及預(yù)擴(kuò)、選擴(kuò)及銀染等過程的優(yōu)化，這些對于其它作物有關(guān)于線粒體DNA的研究極有借鑒價值。試驗(yàn)得到了清晰可辨且多態(tài)性極高的條帶，為進(jìn)一步的研究工作提供大量