昆蟲病原真菌金龜子綠僵菌中性海藻糖酶在孢子儲藏穩(wěn)定性中的作用.pdf

1、蝗蟲是世界性的害蟲，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。金龜子綠僵菌是一種蝗蟲病原真菌，在蝗蟲生物防治中起著重要作用。目前，世界上已經(jīng)有十多個金龜子綠僵菌菌株登記注冊，并實現(xiàn)了商品化，但這些產(chǎn)品常常不穩(wěn)定。阻礙綠僵菌殺蟲劑大規(guī)模應用的主要原因之一是孢子的儲藏和環(huán)境穩(wěn)定性問題。本實驗室從我國蝗蟲病原菌中分離、選育出一株高毒力、高產(chǎn)孢、強?；缘臍⒒刃戮杲瘕斪泳G僵菌CQMa102，用該綠僵菌生產(chǎn)的孢子粉及其油懸浮劑已在國內(nèi)登記注冊，正逐步實現(xiàn)

2、商品化，卻也同樣存在進一步延長儲藏期，增強環(huán)境穩(wěn)定性的問題。 大量研究報道，海藻糖是廣泛存在于各種生物體內(nèi)的抗逆境劑，具有增強生物體對高溫、脫水、干旱、冷凍、高滲透性、重金屬及有毒試劑等逆境的抵抗能力。胞內(nèi)海藻糖積累與絲狀真菌孢子的儲藏期延長密切相關。將釀酒酵母細胞內(nèi)中性海藻糖酶基因敲除后，中性海藻糖酶活性喪失，海藻糖含量提高3倍。由此我們可以推測，通過基因工程技術改變綠僵菌體內(nèi)海藻糖代謝途徑，可以提高孢子內(nèi)海藻糖含量，延長綠僵

3、菌孢子的儲藏期，增強其環(huán)境穩(wěn)定性，促進其商品化生產(chǎn)和應用。 要通過改變海藻糖代謝途徑來改良綠僵菌菌種，就必須了解綠僵菌體內(nèi)海藻糖的代謝和調(diào)控，但是人們對綠僵菌體內(nèi)海藻糖的代謝研究得較少，夏玉先等首先克隆了金龜子綠僵菌中性海藻糖酶基因，但其生物學功能還未見報道。本研究擬通過增加金龜子綠僵菌中性海藻糖酶基因的拷貝數(shù)以減少孢子形成過程中海藻糖的合成，采用基因破壞技術去除或降低金龜子綠僵菌中性海藻糖酶活性以增加孢子中海藻糖含量，并進一步

4、分析孢子中海藻糖的含量及其與孢子抗逆能力和耐儲藏能力的關系，從而闡明中性海藻糖酶在孢子耐熱力和儲藏穩(wěn)定性中的作用。 本研究利用PCR、RT-PCR、RACE、panhandle PCR等方法成功地克隆了金龜子綠僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因，并登錄NCBI 的GenBank，登錄號為：AY557613(基因組序列), AY557612(cDNA序列)。根據(jù)該基因序列構(gòu)建了金龜子綠僵菌中性海藻糖酶超表達載體、同源置換載體和RN

5、A干擾載體，分別利用PEG－CaCl2介導法、電轉(zhuǎn)化法和基因槍法，轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌CQMa102，經(jīng)過PCR篩選和Southern blot 驗證，獲得3個中性海藻糖酶超表達轉(zhuǎn)化菌和3個RNAi轉(zhuǎn)化菌。利用Northern blot分析這幾個突變菌株中性海藻糖酶基因mRNA的含量，選擇中性海藻糖酶基因超表達2倍和中性海藻糖酶基因被抑制到42％的兩個轉(zhuǎn)化菌：Ma113和Ma688，將其與出發(fā)菌株進行分生孢子內(nèi)海藻糖含量的測定，孢子儲藏特性

6、、孢子耐熱性以及生長特性的比較，得出以下結(jié)論： ⑴金龜子綠僵菌分生孢子內(nèi)海藻糖含量隨著孢子成熟度的增加而迅速積累；出發(fā)菌株孢子內(nèi)海藻糖的積累速度比RNA干擾轉(zhuǎn)化菌的積累速度慢，而比超表達轉(zhuǎn)化菌的積累速度快。 ⑵在加速衰老儲藏過程中，成熟孢子比未成熟孢子耐貯；出發(fā)菌株孢子的耐貯性比RNA干擾轉(zhuǎn)化菌低，而比超表達轉(zhuǎn)化菌高。 ⑶在45℃條件下的熱激過程中，成熟孢子比未成熟孢子耐熱激；出發(fā)菌株孢子的耐熱性比RNA干擾轉(zhuǎn)

7、化菌低，而比超表達轉(zhuǎn)化菌高。 ⑷出發(fā)菌株、RNA干擾轉(zhuǎn)化菌和超表達轉(zhuǎn)化菌在固體培養(yǎng)基上的生長情況和產(chǎn)孢率沒有明顯差異。 ⑸根據(jù)以上研究結(jié)果可以得出以下結(jié)論：金龜子綠僵菌中性海藻糖酶的生理功能是通過降解細胞內(nèi)海藻糖以控制胞內(nèi)海藻糖含量，從而間接影響孢子的耐貯性和耐熱激的能力，對孢子的儲藏穩(wěn)定性有重要作用。 本研究成果可為采用發(fā)酵技術和包括基因工程在內(nèi)的育種技術提高蟲生真菌分生孢子的儲藏和環(huán)境穩(wěn)定性提供新的理論依據(jù)和