小擬南芥幾丁質(zhì)酶基因的克隆、序列分析及原核表達.pdf

1、該研究以新疆特色野生植物小擬南芥為材料,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從小擬南芥總RNA中,特異性擴增出約1000bp的cDNA片段,通過T<,4>DNA連接酶將此cDNA片段與PBS-T載體連接,熱擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,藍白斑篩選出陽性菌落,通過菌落PCR、質(zhì)粒PCR擴增及重組質(zhì)粒酶切鑒定,證明其中含有插入基因片段,命名為PBSCH,測序結(jié)果表明所克隆的的PBSCH基因為幾丁質(zhì)酶基因,將測定出的核苷酸序列與國外已報道

2、的擬南芥核苷酸序列及編碼的氨基酸序列進行對比分析,同時進行了限制性內(nèi)切酶酶切位點分析,發(fā)現(xiàn)小擬南芥與擬南芥存在差異.在此基礎(chǔ)上,采用基因重組技術(shù),用BamHⅠ和SalⅠ 同時雙酶切重組質(zhì)粒PBSCH和原核表達載體質(zhì)粒pET-30a,通過T<,4>DNA連接酶將目的基因片段亞克隆入表達載體中,經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒PCR擴增及重組質(zhì)粒酶切鑒定,證實PBSCH基因片段已克隆于原核表達載體pET-30a中,命名為pET-CH.利用熱擊法將重組質(zhì)粒

3、pET-CH轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)中,用IPTG誘導(dǎo)表達,經(jīng)SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物,該基因在分子量略等于40.00KD處獲得高效表達,與預(yù)期分子量40.9KD接近.在原核表達的基礎(chǔ)上,將小擬南芥幾丁質(zhì)酶基因的cDNA定向亞克隆于實踐證明行之有效的中間表達載體PBIN48中,通過抗性篩選、PCR鑒定、酶切鑒定等確證成功地構(gòu)建了植物表達載體PCH.該研究首次成功地從新疆特色野生植物小擬南芥中擴增出幾丁質(zhì)酶基因的cDNA,并成

4、功構(gòu)建了幾丁質(zhì)酶基因的原核表達載體質(zhì)粒pET-CH,通過大腸桿菌對該重組質(zhì)粒進行了初步表達,在原核表達的基礎(chǔ)上,成功地構(gòu)建了植物表達載體PCH.結(jié)果顯示:該基因由985個核苷酸組成,包含一個完整的963bp的開放閱讀框(ORF),編碼321個氨基酸,含有18個限制性內(nèi)切酶酶切位點,通過對克隆的小擬南芥幾丁質(zhì)酶基因與國外報道的擬南芥幾丁質(zhì)酶基因的核苷酸及編碼的氨基酸序列分析,發(fā)現(xiàn)核苷酸、氨基酸的序列組成均有差異,推測可能是由于與擬南芥的種