48298.β葡萄糖苷酶的分子生物學研究

1、北京師范大學碩士學位論文摘要從多粘芽抱桿菌(Bacilluspolynyxa1.794)中克隆得到基因bgIA。將其構建在大腸桿菌(Escherichiacal力表達載體P一葡萄糖普酶pET28a()上，轉化E.callBL21，獲得重組工程菌BL1979。重組表達的0一葡萄糖著酶的酶活力達到24.7工Uml，經(jīng)鎳柱純化后的旦一葡萄糖昔酶最適溫度為370C最適p日值為了.。，該酶經(jīng)純化后用非變性梯度聚丙烯凝膠電泳發(fā)現(xiàn)該酶具有多種寡聚體形

2、式，經(jīng)熒光底物活性染色表明這些寡聚體均具有0一葡萄糖普酶活性。將bg1A基因構建在芽抱桿菌表達載體pWH1520上，采用不帶信號膚編碼序列但帶有自身核糖體結合位點的形式得到一重組質粒pWH1520bg1A。以原生質體轉化方法轉化巨大芽抱桿菌BM70，得到重組菌株BM1979，在有木糖誘導的情況下獲得了胞內表達。用PCR方法從扣囊腹膜抱酵母(Sacchromycopsisfibuligera)的染色體DNA中克隆出0一葡萄糖普酶基因，構建

3、了由酵母乙醇脫氫酶(ADH1)啟動子和終止子引導表達，R一葡萄糖昔酶自身信號膚引導分泌，18srDNA序列介導的酵母整合型分泌表達質粒AX2bgll。計劃以AX2bgll與酵母YEP型G418抗性質粒共轉化野生型工業(yè)酒精酵母，把0一葡萄糖普酶基因整合到酵母染色體上并表達。該基因己在畢氏酵母中得到高效表達，對酶學性質進行分析，該酶最適溫度為500C，最適pH值為5.40關鍵詞:p一葡萄糖昔酶基因克隆表達北京師范大學碩士學位論文第一部分綜述

4、一纖維素酶在生物質降解中的地位和作用1.1自然界中的纖維素資源纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生性資能源物質，微生物對它的轉化降解，構成了生物圈內碳素和能量循環(huán)的主要組成部分。由于天然木質纖維素結構的復雜性和物理結構的異質性，天然纖維素的生物降解也相應是一個復雜的過程，需要多種酶和蛋白因子的共同作用。影響纖維素生物降解效率的纖維素結構特征主要有結晶度、伴生成分、表面積和聚合度。纖維素的聚合度很大，其聚合度可因來源的不同在10014000不等

5、，線形的纖維素大分子有規(guī)則地排列在一起，并且其糖上的輕基幾乎全部包含于氫鍵中，形成的總氫鍵能非常大。通過鏈內和鏈間的氫鍵，加強了纖維素分子間的相互作用，使纖維素的微晶結構很難打開。正是這些氫鍵的大量存在，使得纖維素分子鏈彼此高度牢固的鍵合在一起，成為剛性的高度不溶的微纖絲和纖絲。這是限制纖維素酶對其降解作用的一個主要限制因素(閻伯旭等，1995).植物纖維素是自然界最豐富碳水化合物資源。纖維素分子是由葡糖糖單體通過(14)糖昔鍵連接的線

6、性均聚物(圖1.1.1)。其分子長度依據(jù)來源和所遭受處理萬法不同而有很大差異。這些線性長鏈之間存在著大量氫鍵，賦予纖維素分子很高的剛性，抑制水解作用破壞糖昔鍵時所必須的分子撓曲。因此纖維素分子高度穩(wěn)定，尤其耐受化學攻擊。qH刃H了了‘，o一，0CHOHCHOHHO訣O0HHO召!﹄下書|HH|孟、、卜H01圖1.1.1通過5一(14)糖昔鍵聯(lián)結的葡萄糖長鏈構成纖維素分子Figure1.1.1Linearstructureofcellul