杧果抗逆相關(guān)基因的克隆與表達及其功能初步分析.pdf

1、杧果是我國熱帶地區(qū)的重要水果,已成為熱區(qū)經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)。隨著國家對熱區(qū)經(jīng)濟扶持力度的加大和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,杧果產(chǎn)業(yè)在幫助熱區(qū)農(nóng)民脫貧致富方面起著重要作用。然而,近年來由于全球極端氣候頻繁發(fā)生,低溫和干旱等非生物脅迫成為限制杧果生長發(fā)育和穩(wěn)產(chǎn)的重要環(huán)境因素,嚴重制約了杧果產(chǎn)量和品質(zhì)的提高。研究其在逆境響應(yīng)過程,可加深對逆境反應(yīng)的理解,為深入研究杧果逆境脅迫響應(yīng)的分子機理提供實驗依據(jù)。對其相關(guān)基因功能分析,可以為杧果遺傳改良提供理論依據(jù)

2、和候選基因資源,為培育杧果新品種奠定基礎(chǔ)。
　　本研究以前期逆境脅迫差異顯示分析中發(fā)現(xiàn)的3個對逆境脅迫響應(yīng)顯著的基因片段為對象,以一年多次開花結(jié)果的‘四季’杧果品種為試驗材料,分離克隆了2個新的Rab基因(MiRab5和MiRab11)和一個新的MiRabGDI基因的全長cDNA,對其表達模式和功能進行了初步研究,主要研究結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)前期已獲得的MiRab11基因部分片段,采用RT-PCR結(jié)合5’RACE技術(shù),從

3、“四季杧”混合組織材料(葉、莖、花和果實)中克隆了一個杧果MiRab11基因cDNA全長,其序列長為902bp,包含完整開放閱讀框的657bp,編碼218個氨基酸的推導(dǎo)蛋白,推測分子量大小23.97KD,理論等電點為5.52。經(jīng)BLAST比對及蛋白質(zhì)同源性分析,其具有Rab11亞家族的典型結(jié)構(gòu)特征,將該基因命名為MiRab11(GenBank登錄號:KF768564)。生物信息學(xué)分析顯示:該推導(dǎo)蛋白為親水的中性蛋白質(zhì),定位于線粒體;同源

4、性分析表明,杧果MiRab11與葡萄、柑橘和番茄具有較高的同源性。實時定量PCR結(jié)果表明:MiRab11基因在四季杧不同時期的葉、莖、花和果實中均有表達,其中在嫩莖和嫩葉中的表達量較高;在果實生長發(fā)育初期表達量略有下調(diào),但在果實成熟過程中呈明顯上調(diào)表達趨勢;在不同逆境脅迫(低溫、鹽和干旱)處理后可誘導(dǎo)該基因上調(diào)表達;在不同信號物質(zhì)(脫落酸、水楊酸和雙氧水)刺激下,均可引起該基因的表達上調(diào)。
　　2.根據(jù)MiRab11基因序列和結(jié)構(gòu)

5、域特征,采用重疊PCR定點突變技術(shù),獲得了兩個結(jié)構(gòu)域激活型突變體MiRab11CA和失活型突變體MiRab11DN。將MiRab11基因及突變體構(gòu)建到原核pET-30a表達載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后可誘導(dǎo)其重組蛋白表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示,在28℃條件下,用0.5mmol· L-1 IPTG誘導(dǎo)4 h,可獲得大量可溶性重組蛋白。將可溶性蛋白經(jīng)Ni-NTA argrose層析柱純化后,經(jīng)SDS-PAGE和Western

6、blot證實,上述重組蛋白均可與抗His標簽鼠單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。轉(zhuǎn)化子pET-MiRab11大腸桿菌經(jīng)蛋白誘導(dǎo)表達后,對低溫、高溫和高鹽耐受性顯著提高。激活型突變體pET-MiRab11CA對低溫、高溫和高鹽耐受性略有提高。
　　3.克隆了一個杧果Rab5基因cDNA全長,其序列長為984bp,包含完整開放閱讀框的603bp,編碼200個氨基酸的推導(dǎo)蛋白,預(yù)測蛋白分子量為21.83KD,理論等電點為6.99。經(jīng)BLAS

7、T比對及蛋白質(zhì)同源性分析,其具有Rab5亞家族的典型結(jié)構(gòu)特征,將該基因命名為MiRab5(GenBank,登錄號:KF768563)。同源性分析表明,其與番茄的相似度最高為91％。實時定量PCR結(jié)果顯示:MiRab5基因在四季杧不同階段的葉、莖、花和果實中均有表達,其中在嫩葉和嫩莖中表達量最高;但在果實生長發(fā)育初期表達量呈下降趨勢,在果實成熟過程中表達量增加,呈明顯上調(diào)表達趨勢;在不同逆境脅迫(低溫、鹽和干旱)處理后可誘導(dǎo)該基因上調(diào)表達

8、;在不同信號物質(zhì)(脫落酸、水楊酸和雙氧水)刺激下,除水楊酸出現(xiàn)下調(diào)表達外,脫落酸和雙氧水均可引起該基因不同程度的上調(diào)表達。采用重疊PCR定點突變技術(shù),獲得了兩個結(jié)構(gòu)域突變體Mi-Rab5CA和Mi-Rab5DN。將該基因及其突變體構(gòu)建到原核表達載體pET-30a上獲得融合重組表達載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3),可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量可溶性重組蛋白。純化后,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot證實,上述重組蛋白均可與抗6-His標

9、簽鼠單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。轉(zhuǎn)化子pET-MiRab5大腸桿菌經(jīng)蛋白誘導(dǎo)表達后,對低溫、高溫和高鹽耐受性顯著提高。但激活型突變體pET-MiRab5CA對低溫、高溫和高鹽耐受性提高不大,失活型pET-MiRab5DN耐受性最差。
　　4.克隆了一個杧果MiRab-GDI基因,其cDNA全長為1449bp,包含完整開放閱讀框1335bp,編碼444個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量為49.75KD,理論等電點5.48。其推導(dǎo)蛋白具有GD

10、I家族已知的典型結(jié)構(gòu)和功能序列結(jié)構(gòu)殘基,與煙草Rab-GDI相似度最高為92%,命名為MiRab-GDI(GenBank登錄號:KF768565)。實時定量PCR分析顯示,該基因在四季杧不同階段的葉、莖、花和果實中均有表達,其中在嫩莖和老莖中表達較高;在果實生長發(fā)育初期下調(diào)表達,但在果實成熟過程中上調(diào)表達;在不同逆境脅迫(低溫、鹽和干旱)處理后均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)表達;在不同信號物質(zhì)(脫落酸、水楊酸和雙氧水)刺激下,可誘導(dǎo)該基因出現(xiàn)不同

11、程度的上調(diào)表達。將該基因構(gòu)建原核重組表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3),可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量可溶性重組蛋白,該重組蛋白可與抗6-His標簽鼠單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。轉(zhuǎn)化子pET-MiRab-GDI大腸桿菌經(jīng)蛋白誘導(dǎo)后,對低溫、高溫和高鹽耐受性明顯高于僅轉(zhuǎn)化pET-30a的對照。
　　5.將MiRab11基因及突變體、MiRab5基因及突變體和MiRab-GDI基因分別構(gòu)建到植物雙元表達載體pBI121上,轉(zhuǎn)化擬南芥,并對轉(zhuǎn)基

12、因陽性植株進行了篩選,得到了7株轉(zhuǎn)化苗(3株pBI-MiRab5、1株pBI-MiRab5CA、1株pBI-MiRab5DN、1株pBI-MiRab11和1株pBI-MiRab11CA)。T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥pBI-MiRab5、pBI-MiRab5CA和pBI-MiRab5DN植株在表型上存在較大差異,pBI-MiRab5DN生長勢最好,激活型突變體pBI-MiRab5CA最差;T2代轉(zhuǎn)基因pBI-MiRab5植株對低溫和干旱適應(yīng)能力強

13、于激活型突變體pBI-MiRab5CA。
　　總之,本研究從杧果中分離鑒定出2個Rab和一個Rab-GDI基因,初步功能分析表明:上述基因均參與低溫、干旱和鹽的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程;均能在果實生長發(fā)育初期或成熟過程中呈規(guī)律性的下調(diào)或上調(diào)表達;在不同逆境脅迫(低溫、鹽和干旱)和不同信號刺激物(脫落酸、水楊酸和雙氧水)處理后均能誘導(dǎo)其基因的表達;上述基因及突變體均能在大腸桿菌中特異性表達重組蛋白。轉(zhuǎn)化子pET-MiRab5、pET-MiRab

14、11和pET-MiRab-GDI大腸桿菌對低溫、高溫和高鹽耐受性明顯提高;轉(zhuǎn)基因MiRab5擬南芥過量表達可提高植株對低溫和干旱的適應(yīng)能力。研究結(jié)果表明,MiRab5、MiRab11和MiRab-GDI通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控重要的生理活動,其功能除與逆境脅迫有關(guān)外,還可能與果實的發(fā)育和成熟有關(guān)。本研究為植物ABA的調(diào)控表達途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了實驗證據(jù),有利于理解杧果響應(yīng)逆境脅迫的分子機理和果實成熟機理,為進行杧果逆境遺傳改良儲備了候選基因