桑樹(shù)花青素生物合成相關(guān)基因的鑒定及功能研究.pdf

1、花青素是一種重要的植物水溶性色素，廣泛分布于多種植物體內(nèi)，是形成植物花和果實(shí)顏色的主要色素?；ㄇ嗨夭粌H在植物自身生理生化活動(dòng)中起到重要的作用，而且還具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等多種生物學(xué)活性。
　　花青素在結(jié)構(gòu)上屬于類黃酮化合物，其生物合成屬于類黃酮生物合成的一部分，這是一個(gè)復(fù)雜的合成途徑，涉及眾多合成基因和調(diào)控基因的參與。目前該途徑已在一些模式植物中被闡明。
　　桑樹(shù)是一種多年生木本植物，除了傳統(tǒng)上作為家蠶的食物

2、來(lái)源外，桑樹(shù)還具有很多其它重要應(yīng)用，包括生態(tài)保護(hù)、中醫(yī)資源、營(yíng)養(yǎng)保健等。其中桑椹因味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富而備受人們青睞?；ㄇ嗨厥巧ｉ┲泻控S富的一種營(yíng)養(yǎng)成分，且具有極高的生物學(xué)活性。目前已有超過(guò)11種花青素在桑樹(shù)中被鑒定，含量最豐富的分別是矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷。研究桑椹中花青素生物合成途徑對(duì)促進(jìn)果桑品質(zhì)改良具有重要意義。
　　本研究利用生物信息學(xué)方法，從桑樹(shù)全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了參與桑樹(shù)花青素生物

3、合成的相關(guān)基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。同時(shí)，我們選取了兩種不同果色的桑樹(shù)栽培種材料，利用qRT-PCR研究了所鑒定得到基因在桑椹成熟過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平變化，并利用Western blotting技術(shù)對(duì)關(guān)鍵基因所編碼的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了確定，同時(shí)結(jié)合UPLC技術(shù)鑒定和測(cè)量了桑椹成熟過(guò)程中花青素的種類和含量變化，研究了該過(guò)程中桑樹(shù)花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平與花青素含量之間的關(guān)系。通過(guò)構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研究了桑樹(shù)花

4、青素生物合成關(guān)鍵基因的功能和啟動(dòng)子活性。本研究所獲得研究結(jié)果如下:
　　1、桑樹(shù)花青素生物合成相關(guān)基因的鑒定和信息學(xué)分析
　　利用生物信息學(xué)方法，我們?cè)谝褱y(cè)序的川?；蚪M中鑒定得到9個(gè)花青素生物合成相關(guān)基因，包括兩個(gè)CHS、F3H、F3'H和一個(gè)CHI、DFR、ANS，并且以川桑cDNA為模板成功克隆得到除ANS外的其他8個(gè)基因（我們?cè)趶V東桑品種粵椹大10中克隆得到ANS基因）。在川?；蚪M中沒(méi)有鑒定到F3'5'H基因?；?/p>

5、結(jié)構(gòu)分析表明，鑒定得到的9個(gè)基因全部含有內(nèi)含子，內(nèi)含子數(shù)目和位置與其他植物中報(bào)道的相應(yīng)基因的結(jié)果相一致。
　　將鑒定得到的桑樹(shù)花青素生物合成相關(guān)基因與其他植物中相對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除F3H2的序列相似性較低外（小于40％），其余8個(gè)基因的序列相似性都較高（65％到93％）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和多序列比對(duì)分析表明這些基因所編碼的蛋白質(zhì)都具有保守的行使各自催化活性所需的結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)。
　　在plantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)鑒定

6、到的桑樹(shù)花青素生物合成相關(guān)基因上游啟動(dòng)子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其主要分為三類，第一類是光響應(yīng)元件，這也是存在數(shù)目最多的一類，如BoxⅠ、G-Box、ATCC-motif等;第二類是一些激素響應(yīng)元件，如ABRE元件響應(yīng)脫落酸反應(yīng)、ERE元件響應(yīng)乙烯反應(yīng)、CGTCA-motif和TGACG-motif響應(yīng)茉莉酸甲酯反應(yīng)等;第三類是一些脅迫響應(yīng)元件，如Box-W1響應(yīng)真菌激發(fā)反應(yīng)、HSE元件響應(yīng)熱脅迫反應(yīng)、LTR元件響應(yīng)低溫脅迫反應(yīng)等

7、。此外，在F3'H1、DFR和ANS上游還分別發(fā)現(xiàn)了MBSⅠ和MBSⅡ元件，這是和類黃酮生物合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子的作用位點(diǎn)，這也暗示桑樹(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子作為花青素生物合成的調(diào)節(jié)基因?qū)ο嚓P(guān)的結(jié)構(gòu)基因起到調(diào)控作用。
　　2、不同果色桑椹成熟過(guò)程中花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析
　　利用qRT-PCR技術(shù)研究了桑樹(shù)花青素生物合成相關(guān)基因在川桑六個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明這些基因的組織表達(dá)模式差別很大，同一基因家族的不同成員之

8、間也表現(xiàn)出很大的差別，例如MnCHS1特異性的在雄花中表達(dá)，而MnCHS2主要在根和雌花中表達(dá)，并且MnCHS1的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于MnCHS2; MnF3H1主要在根和雄花中表達(dá)，而MnF3H2卻主要在莖、葉和雌花中表達(dá);MnF3'H1特異的在根中表達(dá)，而MnF3'H2卻在多個(gè)組織中都有表達(dá)。這種表達(dá)差異暗示了同一基因家族中不同成員之間的功能和調(diào)控上可能存在差異。在川桑六個(gè)組織中都沒(méi)有檢測(cè)到MnANS的表達(dá)，這與六個(gè)組織中都沒(méi)有檢測(cè)的花青

9、素積累的結(jié)果相一致。
　　我們選取了兩種不同果色的桑樹(shù)品種（紫色果實(shí)的粵椹大10和白色果實(shí)的珍珠白），首先利用Southern blotting技術(shù)檢測(cè)了花青素生物合成相關(guān)基因在川桑和這兩種栽培桑中的拷貝數(shù)情況，結(jié)果表明這些基因在兩種栽培桑中的雜交模式比較一致，并且其拷貝數(shù)比川桑中要多。然后我們利用qRT-PCR技術(shù)研究了桑樹(shù)花青素生物合成相關(guān)基因在桑椹成熟過(guò)程中的表達(dá)情況，根據(jù)表達(dá)模式的差別將這些基因分為四類，其中TypeⅠ類基

10、因包括CHS1、CHI、F3H1、F3'H1和ANS，其在大10中的轉(zhuǎn)錄水平隨著桑椹的成熟而增加，但在珍珠白中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。對(duì)于花青素生物合成途徑后期的兩個(gè)關(guān)鍵基因DFR和ANS，我們通過(guò)制備其多克隆抗體，在蛋白水平上進(jìn)一步檢測(cè)其表達(dá)情況。Western blotting結(jié)果表明ANS的蛋白水平表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄水平相一致，但DFR卻相反，其轉(zhuǎn)錄水平隨著粵椹大10桑椹的成熟而下降，但蛋白水平卻增加，由此我們推測(cè)DFR存在一種轉(zhuǎn)錄水平上的

11、負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　利用UPLC技術(shù)對(duì)粵椹大10和珍珠白桑椹成熟過(guò)程中的花青素成分進(jìn)行了鑒定和定量，結(jié)果表明粵椹大10桑椹中的花青素主要為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷，這與之前的研究報(bào)道相一致?；ㄇ嗨睾侩S著桑椹的成熟而增加，并且在成熟后期出現(xiàn)急劇的增加，其中矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的增加更為明顯。在珍珠白的整個(gè)成熟過(guò)程中都沒(méi)有檢測(cè)到花青素的存在。該結(jié)果與花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)情況相一致。

12、>　　之前關(guān)于桑樹(shù)花青素鑒定的研究表明桑樹(shù)中的花青素主要為矢車(chē)菊素類衍生物和少量的天竺葵素衍生物，本研究中鑒定到的桑樹(shù)花青素也主要為矢車(chē)菊素類衍生物。分析植物花青素合成途徑可以看出這些不同類型的花青素都是從共同的前體柚皮素合成而來(lái)的，在桑樹(shù)的基因組中沒(méi)有鑒定到F3'5'H基因，F(xiàn)3'5'H是合成翠雀素相關(guān)的基因，推測(cè)桑樹(shù)中缺乏翠雀素可能是由于F3'5'H基因的缺失所致。另一方面，多序列比對(duì)分析表明桑樹(shù)的MnDFR屬于Asp類型的DFR，

13、該類DFR不能有效的將二氫山奈酚轉(zhuǎn)化成無(wú)色天竺葵素，所以導(dǎo)致桑樹(shù)中的花青素主要為矢車(chē)菊素類衍生物。
　　3、桑樹(shù)花青素生物合成相關(guān)基因的功能研究
　　我們利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在擬南芥中對(duì)MnDFR的啟動(dòng)子活性進(jìn)行分析，結(jié)果表明在正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，MnDFR的啟動(dòng)子只在其根部有活性，并且當(dāng)黑暗處理時(shí)，其活性會(huì)降低，但是當(dāng)進(jìn)行高溫處理后，可誘導(dǎo)其在葉片和葉芽處行使活性，這暗示MnDFR可能參與高溫脅迫引起的反應(yīng)。
　

14、　同樣地，我們將桑樹(shù)花青素生物合成途徑后期的兩個(gè)關(guān)鍵基因MnDFR和MnANS轉(zhuǎn)化到擬南芥中，觀察其對(duì)擬南芥花青素累積的影響。結(jié)果表明與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥從開(kāi)始抽薹起，其莖的基部表現(xiàn)出明顯的紅色。在莖的生長(zhǎng)過(guò)程中，整個(gè)植株的莖都能表現(xiàn)出淡紅色，并且這種表型變化在轉(zhuǎn)MnANS的植株中更為明顯。這可能是由于在花青素生物合成通路中，ANS是更下游的酶，所以其催化作用對(duì)花青素的合成能產(chǎn)生更直接的影響。
　　我們利用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法，將除M

15、nANS外的其余8個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入到煙草中，在煙草中實(shí)現(xiàn)目的基因的過(guò)量表達(dá)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)和表型并沒(méi)有出現(xiàn)明顯變化，但是對(duì)煙草花朵進(jìn)行花青素提取與定量分析表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草花朵中的花青素含量出現(xiàn)變化，其中轉(zhuǎn)MnCHS1、MnCHS2、MnCHI和MnDFR煙草植株的花青素含量增加，轉(zhuǎn)MnF3H1和MnF3H2的煙草植株花青素含量出現(xiàn)下降，轉(zhuǎn)MnF3'H1和MnF3'H2的煙草植株的花青素含量沒(méi)有明顯變化。
　　

16、本研究利用生物信息學(xué)方法從川?；蚪M中鑒定得到9個(gè)花青素生物合成相關(guān)基因，信息學(xué)分析表明與其它植物中相對(duì)應(yīng)的基因相比，這些基因在序列、結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、催化活性位點(diǎn)上都存在較高的保守性，暗示了其功能的一致性。在兩種不同果色桑椹成熟過(guò)程中的qRT-PCR、Western blotting、 UPLC等實(shí)驗(yàn)表明鑒定得到的桑樹(shù)花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平與桑椹中花青素的積累密切相關(guān)，并且推測(cè)出桑樹(shù)中F3'5'H基因的缺失和DFR的底物特異性是