‘鐘山紅’葡萄雄性不育形成機(jī)理研究.pdf

1、‘鐘山紅’（‘魏可’自交后代）為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的一個(gè)優(yōu)良種質(zhì)，雄蕊花絲短，且反卷，花粉無活力，自然授粉果穗大小粒果現(xiàn)象嚴(yán)重，出現(xiàn)大量無核果;花前套袋全為無核果實(shí);判定其為葡萄雄性不育，2011年11月通過江蘇省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)鑒定為葡萄新品種。葡萄雌能花品種是雜種優(yōu)勢利用的一種重要遺傳工具和途徑，且是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)無核商品葡萄的重要途徑之一。明確葡萄雄性不育發(fā)生的機(jī)理，有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究以雌能花新品種‘鐘山紅

2、’和其可育親本‘魏可’為試驗(yàn)材料，采用酶聯(lián)免疫技術(shù)對(duì)葡萄花蕾進(jìn)行內(nèi)源激素的測定?？寺×丝赡芘c花藥發(fā)育及雄性不育相關(guān)的差異表達(dá)基因Vvms2和Vvmyb4，并對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、熒光定量分析及功能初步分析;構(gòu)建了Vvmyb4的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化野生型煙草驗(yàn)證該基因的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測技術(shù)對(duì)花藥發(fā)育不同時(shí)期（1.造孢期、2.花粉母細(xì)胞期、3.減數(shù)分裂期、4.四分體期、5.單

3、核期、6.二核期、7.成熟花粉期）的花蕾組織中的吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GAs)、細(xì)胞分裂素(CTK)、脫落酸(ABA)含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明:‘鐘山紅’與‘魏可’花蕾中的IAA，GAs的含量在減數(shù)分裂期之前差異不顯著，在四分體期及單核期‘鐘山紅’顯著低于‘魏可’?！娚郊t’中的CTK含量在減數(shù)分裂期之前顯著低于‘魏可’?！嚎伞趩魏似贏BA含量開始降低，而‘鐘山紅’在二核期才開始降低?！娚郊t’的IAA/ABA和GAs/ABA在

4、二核期之前明顯高于‘魏可’且比‘魏可’比值變化較大，因此認(rèn)為IAA，GAs，CTK的虧缺，ABA的延后降低及IAA／ABA，GAs/ABA比例失調(diào)與葡萄雄性不育有一定的關(guān)系。
　　2.在NCBI中尋找與擬南芥雄性不育基因MS2同源性最高的葡萄序列(CBI29968)，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行克隆測序，通過生物信息學(xué)方法分析結(jié)構(gòu)特征，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)研究其在‘魏可’各組織中及‘魏可’和‘鐘山紅’雄蕊發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)特性。

5、結(jié)果表明:VvMS2基因cDNA編碼區(qū)全長為1755bp，編碼584個(gè)氨基酸，舍有NAD結(jié)合域和雄性不育C-末端區(qū)域。VvMS2對(duì)應(yīng)基因組DNA全長2776bp，含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。基因編碼蛋白質(zhì)分子量為64.74kD，等電點(diǎn)為8.84。該基因與GenBank中其他來源的MS2蛋白序列的相似性為40％～71％。Vvms2為花蕾特異表達(dá)基因，且僅在花粉發(fā)育四分體期到二核期有表達(dá)，單核期‘魏可’的表達(dá)量顯著高于同時(shí)期‘鐘山紅’。推測

6、該基因異常表達(dá)與‘鐘山紅’葡萄雌能花形成有關(guān)。
　　3.在NCBI中尋找與擬南芥雄性不育基因VvMYB4同源性最高的葡萄序列，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行克隆測序，通過生物信息學(xué)方法分析結(jié)構(gòu)特征，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)研究其在‘魏可’和‘鐘山紅’雄蕊發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)特性。VvMYB4基因cDNA編碼區(qū)全長為978bp，編碼325個(gè)氨基酸，含有R2R3兩個(gè)保守的功能域。VvMYB4對(duì)應(yīng)基因組DNA全長1174bp，含有3個(gè)外顯子和

7、2個(gè)內(nèi)舍子。基因編碼蛋白質(zhì)分子量為35.75kD，等電點(diǎn)為6.75。該基因與GenBank中其他來源的VvMYB4蛋白序列的相似性為67％-87％。在花藥發(fā)育的不同發(fā)育時(shí)期，VvMYB4在可育品種‘魏可’中表達(dá)量都很低，只有在二核期和成熟花粉期才檢測到相對(duì)其他發(fā)育時(shí)期較高的VvMYB4的表達(dá)。但在不育品種‘鐘山紅’中，VvMYB4在四分體時(shí)期表達(dá)量突然升到了頂峰，隨后到單核期迅速降低，到二核期和成熟花粉期表達(dá)量極低或基本不表達(dá)。推測該基

8、因異常表達(dá)與‘鐘山紅’葡萄雌能花形成有關(guān)。
　　4.構(gòu)建了VvMYB4基因的植物表達(dá)載體，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)，采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草葉片，獲得抗性植株?？剐灾仓杲?jīng)GUS，PCR及RT-PCR檢測篩選，最后得到2個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因煙草。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行培養(yǎng)觀察，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草在營養(yǎng)生長階段并無明顯差異。到開花期，轉(zhuǎn)基因植株雌蕊、花萼與野生型植株之間無明顯差異。但轉(zhuǎn)基因植株雄蕊、花藥、花絲及花瓣顏色