狂犬病毒街毒株DRV-AH08基因組序列測(cè)定分析及G蛋白免疫原性研究.pdf

1、狂犬病是一種古老的而又持續(xù)流行至今的自然疫源性疾病。由于其發(fā)病后100％的致死率，狂犬病在全球范圍內(nèi)每年會(huì)奪走近5.5萬人的生命。中國(guó)是發(fā)病例數(shù)僅次于印度的狂犬病肆虐區(qū)，正在經(jīng)歷新中國(guó)成立以來的第三次狂犬病大流行，年均約2000～3000患者因此而喪生。
　　作為一種負(fù)鏈RNA病毒，狂犬病毒遺傳變異很快。國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)(ICTV)于2012年將全球的狂犬病毒屬分為RABV、LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、EBLV-

2、2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV、WCBV和HIBV共12個(gè)基因型，我國(guó)目前主要流行的為RABV狂犬病毒。
　　G蛋白是狂犬病毒的主要毒力決定因素。研究發(fā)現(xiàn)狂犬病毒弱毒株與街毒株致病性不同的主要原因之一是G蛋白的表達(dá)水平不同。
　　鑒于此，本研究針對(duì)2008年分離自中國(guó)安徽犬腦的一株狂犬病毒街毒株DRV-AH08進(jìn)行基因組序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)一步研究該毒株與弱毒株ERA株G蛋白表達(dá)量、免疫原性和重組疫苗對(duì)小鼠

3、的免疫效果的差異。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、狂犬病毒街毒株DRV-AH08的分類鑒定及全基因組序列測(cè)定
　　RT-nestPCR擴(kuò)增結(jié)果表明，DRV-AH08屬RABV狂犬病毒。據(jù)此，設(shè)計(jì)了10對(duì)引物完成了基因組序列的擴(kuò)增及拼接，DRV-AH08GeneBank號(hào):HQ450385。
　　2、DRV-AH08基因組結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化分析
　　DRV-AH08株基因組全長(zhǎng)11924個(gè)核苷酸(nt)，基因組編碼基因如下

4、:N1353nt，P891nt，M609nt，G1575nt和L6384nt。DRV-AH08全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明:世界范圍內(nèi)基因Ⅰ型狂犬病毒屬可分為cladeⅠ、Ⅱ和Ⅲ3個(gè)進(jìn)化分支，DRV-AH08屬于cladeⅠ。推導(dǎo)的G氨基酸序列分析表明:cladeⅠ和Ⅱ狂犬病毒起源于共同的祖先cladeⅢ，且cladeⅡ與cladeⅢ的親緣關(guān)系Ⅰ更近。分子鐘分析結(jié)果證實(shí):cladeⅠ和Ⅱ狂犬病毒約于939～1536年前由cladeⅢ分化

5、而來，而cladeⅠ和Ⅱ約于195～670年前開始進(jìn)化成不同的分支。
　　3、地域環(huán)境產(chǎn)生的選擇壓力會(huì)影響病毒進(jìn)化
　　不同地域環(huán)境下的兩個(gè)優(yōu)勢(shì)毒株（DRV-AH08，ChinaⅠ，當(dāng)前流行于中國(guó);DRV-Mexico，D11，流行于墨西哥）氨基酸比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其N、G和L蛋白共存在17個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異。推測(cè)這些變異與病毒的復(fù)制和毒力關(guān)聯(lián)很大，如當(dāng)前中國(guó)狂犬病流行趨勢(shì)中病程縮短等。
　　4、不同毒力毒株G蛋白表達(dá)差異研究

6、
　　本研究以桿狀病毒為載體，構(gòu)建了表達(dá)弱毒株ERA和街毒株DRV-AH08G蛋白的8個(gè)重組桿狀病毒。細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明:弱毒株G蛋白在昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(BHK)中的表達(dá)量均高于街毒株;且弱毒株G蛋白生物學(xué)活性更好，在重組桿狀病毒上攜帶量更多。
　　5、DRV-AH08和ERA株G蛋白免疫原性研究
　　首先，我們以等量(1×108PFU)重組桿狀病毒免疫小鼠，一免、二免后表達(dá)弱毒株G蛋白的疫苗免疫組小鼠體內(nèi)NA水平更高

7、;攻毒后體重變化更少，臨床癥狀更輕，存活率也更高:BAC-E1-E2(100％)＞BAC-E1-S2(90％)＞BAC-S1-E2(80％)＞BAC-S1-S2(66.7％)＞BAC-E1(60％)＞BAC-E2(40％)＞BAC-S2(10％)＞BAC-S1(0％)。繼而，我們以攜帶等量G蛋白的重組桿狀病毒BAC-E1(1×108PFU)和BAC-S1(2×108PFU)免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BAC-S1免疫組小鼠仍無（一免后）或者僅有

8、很低的NA（二免后）產(chǎn)生，無法對(duì)小鼠產(chǎn)生有效保護(hù)（保護(hù)率0％）。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):弱毒株G蛋白的免疫原性顯著優(yōu)于街毒株G蛋白。
　　同時(shí)，表達(dá)2個(gè)拷貝G基因的重組疫苗BAC-E1-E2能顯著提高疫苗的免疫效力，在低免疫劑量下即可對(duì)小鼠達(dá)到100％的免疫保護(hù)，可用于狂犬病的預(yù)防和控制。該策略也提示我們今后狂犬病疫苗的研發(fā):可通過同時(shí)插入多個(gè)免疫原性好的基因及趨化因子等進(jìn)行共表達(dá)，以更好激發(fā)機(jī)體先天免疫及誘導(dǎo)特異性免疫，進(jìn)而達(dá)到更理想