大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4和GmPAP14克隆與功能研究.pdf

1、土壤磷素多數(shù)以有機(jī)態(tài)形式存在,不能被植物直接吸收利用。酸性磷酸酶具有分解利用有機(jī)態(tài)磷、提高磷素吸收利用效率的作用,因而克隆酸性磷酸酶基因,并轉(zhuǎn)化作物,對(duì)于解決當(dāng)前土壤有效磷不足、植物磷素缺乏等問(wèn)題具有重要意義。本研究利用磷素高效大豆品種“中黃15”,克隆酸性磷酸酶基因,經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR和轉(zhuǎn)基因擬南芥磷營(yíng)養(yǎng)分析研究候選基因的生物學(xué)功能,為磷高效轉(zhuǎn)基因育種提供功能基因。研究結(jié)果如下:
　　 1.克隆獲得了2個(gè)紫色酸性磷酸酶GmPAP

2、4和GmPAP14。GmPAP4含有1329bp開(kāi)放讀碼框,編碼442個(gè)氨基酸殘基;GmPAP14含有1395bp開(kāi)放讀碼框,編碼464個(gè)氨基酸殘基。
　　 2.實(shí)時(shí)定量分析了不同大豆品種GmPAP4的表達(dá)差異性。植酸磷(有機(jī)態(tài)磷)為唯一磷源條件下,磷高效品種“中黃15”的GmPAP4表達(dá)量在植酸磷處理15d～70d明顯高于磷低效品種“牛毛黃”,表明GmPAP4與植酸磷的吸收利用相關(guān)。
　　 3.實(shí)現(xiàn)了紫色酸性磷酸酶Gm

3、PAP4的原核表達(dá)。經(jīng)構(gòu)建表達(dá)載體pET32a-GmPAP4,28℃條件下IPTG誘導(dǎo)12h出現(xiàn)61.2Kda目的條帶;進(jìn)一步分離純化目的條帶,并測(cè)定其磷酸酶活性發(fā)現(xiàn),目的蛋白具有分解ρ-NPP(硝基苯酚磷酸酯二鈉鹽,有機(jī)態(tài)磷)的能力,且以pH5.0時(shí)磷酸酶活性最高。
　　 4.分析了GmPAP4編碼蛋白在植物細(xì)胞中的定位情況。經(jīng)構(gòu)建融合表達(dá)載體pCamE-GmPAP4::GFP,基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)pCamE-G

4、mPAP4::GFP細(xì)胞的細(xì)胞膜(壁)呈現(xiàn)明顯綠色熒光,表明GmPAP4發(fā)揮功能的部位在植物細(xì)胞膜或者分泌到胞外。
　　 5.分析了GmPAP4蛋白在植物不同組織中的定位情況。經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)將pCamE-GmPAP4::GFP轉(zhuǎn)入擬南芥,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的根部維管束組織及植株開(kāi)花期的花粉粒呈現(xiàn)明顯綠色熒光,表明GmPAP4與擬南芥根部磷素運(yùn)輸和花粉粒形成有關(guān)。
　　 6.研究了GmPAP4在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的生物