鴨瘟病毒SDWF株的分離鑒定及致病性研究.pdf

1、鴨瘟(DuckPlague，DP)，是由鴨瘟病毒(Duckplaguevirus，DPV)引起的鴨、鵝和天鵝等水禽的一種急性接觸性傳染病，其特征是流行廣泛、傳播迅速、發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。
　　 鴨瘟于1923年由Baudet首次在荷蘭報(bào)道，之后在許多國(guó)家均有流行。1957年黃引賢在我國(guó)廣州報(bào)道了本病。至今，全國(guó)各養(yǎng)鴨地區(qū)均有本病流行的報(bào)道，為了更有效的防治DPV，有必要發(fā)展簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法和良好的病原檢測(cè)

2、及定位手段，并對(duì)其致病機(jī)理進(jìn)行深入研究。本研究?jī)?nèi)容包括四部分：
　　 一、鴨瘟病毒SDWF株的分離鑒定
　　 通過鴨胚尿囊膜接種，從疑似鴨瘟病例中分離到1株病毒，采用血清中和試驗(yàn)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)和PCR方法對(duì)分離毒株進(jìn)行了鑒定，并對(duì)毒株的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，分離毒株人工感染SPF鴨的癥狀及剖檢變化與自然感染病例相同；分離株無血凝活性；鴨胚半數(shù)致死量ELD50為10-4.33/0.2mL；對(duì)氯仿、乙醚敏

3、感；不耐酸堿、不耐熱。分離毒株P(guān)CR鑒定結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物與預(yù)期大小一致，其產(chǎn)物序列與鴨瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株相應(yīng)片段核苷酸的同源性為99.9％。上述結(jié)果表明，分離毒株為DPV，且為強(qiáng)毒株，命名為SDWF株。
　　 二、鴨瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　 為建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異的DPV檢測(cè)方法，本研究根據(jù)GenBank中登錄的DPV基因組序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)

4、引物，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)體系，建立了LAMP快速檢測(cè)方法。結(jié)果表明，LAMP方法能夠在63℃恒溫下，1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)目的核酸的大量擴(kuò)增。結(jié)果判定時(shí)只需要在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBRGreenⅠ染料，就可以直接在可見光或紫外光下觀察顏色變化。該方法敏感性可達(dá)0.245pg/μL，比普通PCR靈敏性高10倍；對(duì)Ⅰ型鴨肝炎病毒、H9N2亞型禽流感病毒、鴨新城疫病毒、鴨源偏肺病毒等的核酸無交叉反應(yīng)；利用建立的LAMP檢測(cè)方法對(duì)40份臨床樣品的陽性檢出率為30％。

5、該方法簡(jiǎn)便快捷，省時(shí)省力，是一種適用于基層實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確檢測(cè)DPV的方法。
　　 三、鴨瘟病毒強(qiáng)毒株感染SPF鴨動(dòng)態(tài)病理組織學(xué)研究
　　 將純化的DPV人工感染2月齡SPF鴨，定期剖殺試驗(yàn)組和對(duì)照組鴨，對(duì)各組織器官的病理組織學(xué)變化進(jìn)行觀察，并進(jìn)行血常規(guī)和血液生化指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果顯示：人工感染后24h，感染SPF鴨中樞免疫器官胸腺、法氏囊淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，組織間隙增大；肝臟、脾臟組織病變較為嚴(yán)重，其余組織器官均出現(xiàn)程度較輕

6、的病理變化。感染后48～96h，中樞免疫器官的淋巴細(xì)胞極度減少，網(wǎng)狀細(xì)胞增生，組織器官結(jié)構(gòu)模糊不清，嚴(yán)重充血、出血；其余組織器官出現(xiàn)細(xì)胞變性、出血等病理變化。感染后120h，組織細(xì)胞變性、壞死，出現(xiàn)大片壞死區(qū)。點(diǎn)眼滴鼻組SPF鴨感染DPV后組織學(xué)變化與皮下注射組相似，只是發(fā)生的時(shí)間推后約24～48h。對(duì)照組SPF鴨病理組縱學(xué)觀察未見損傷。WBC、HGB、AST、ALT等發(fā)生顯著變化。該結(jié)果表明，接種DPV強(qiáng)毒感染SPF鴨的組織器官嚴(yán)重受

7、損，特別是免疫器官，甚至?xí)鹈庖咭种啤?br>　　 四、間接免疫熒光染色(IFA)檢測(cè)鴨瘟病毒及在鴨體內(nèi)的抗原定位
　　 將純化的DPV免疫清潔級(jí)新西蘭白兔，高免血清經(jīng)辛酸-硫酸銨法和葡聚糖G200柱純化，制得第一抗體。以FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG為第二抗體，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了DPV間接免疫熒光(IFA)快速診斷方法。試驗(yàn)結(jié)果表明：一抗的最佳稀釋度為1:100,感作時(shí)間為4℃過夜；二抗的最佳工作濃度為1:200,感