桔小實蠅抗熱脅迫反應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、桔小實蠅Bactrocera dorsalis隸屬于雙翅目Diptera，實蠅科Tephritidae，是一種重要的世界性害蟲。該蟲可為害46個科的250多種水果和蔬菜，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。桔小實蠅具有很強(qiáng)的擴(kuò)散性和環(huán)境適應(yīng)性，能進(jìn)行遠(yuǎn)距離擴(kuò)散并迅速占領(lǐng)入侵地。該蟲原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)已成為中國南部、東南亞、印度次大陸和夏威夷群島危險性果蔬害蟲，這些地區(qū)的夏季高溫往往高于40℃；隨著全球氣候變暖，桔小實蠅逐漸向高緯度地區(qū)擴(kuò)散，在

2、中國湖北、江蘇等冬季溫度低于0℃的地區(qū)也可完成越冬。桔小實蠅適宜發(fā)育的溫度范圍在15～34℃之間，因此，夏季高溫和冬季低溫等極端溫度必將對桔小實蠅造成熱脅迫。在長期的進(jìn)化過程中，桔小實蠅形成了一系列反應(yīng)機(jī)制來應(yīng)對熱脅迫。熱激蛋白是細(xì)胞或生物體在受熱或其他因素刺激后，所產(chǎn)生的一類在生物進(jìn)化中最保守并由熱休克基因所編碼的伴隨細(xì)胞蛋白，與生物體的熱耐受性和抗逆性有重要的關(guān)系。熱脅迫帶來的氧化壓力使生物體內(nèi)產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，而抗氧化系統(tǒng)則可以清除

3、氧自由基，緩解氧化壓力，修復(fù)脅迫損傷等。以雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)為核心的蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為分離鑒定昆蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)創(chuàng)造了有利條件。差異蛋白質(zhì)組學(xué)的興起，更是為分離已知的熱脅迫應(yīng)激蛋白，以及去尋找那在抗熱脅迫響應(yīng)過程中起作用的未知蛋白提供了有利工具。
　　 本學(xué)位論文以桔小實蠅為研究對象，在全球氣候變暖的大環(huán)境下，瞄準(zhǔn)生物適應(yīng)熱脅迫這一國際研究熱點(diǎn)，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離并鑒定了熱脅迫下桔小實蠅的響應(yīng)蛋白；采用微量滴定酶標(biāo)板法

4、測定了其體內(nèi)抗氧化酶活性的變化；利用RT-PCR、RACE及qPCR等技術(shù)克隆并解析了桔小實蠅熱激蛋白基因和抗氧化酶基因及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式，從不同角度闡明了桔小實蠅對熱脅迫的響應(yīng)機(jī)制。經(jīng)過近3年的研究，獲得以下主要結(jié)果：
　　 1.桔小實蠅在熱脅迫下的抗氧化反應(yīng)
　　 丙二醛(MDA)是多元未飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)的主要氧化產(chǎn)物，可以通過測定其含量來明確脂質(zhì)過氧化的水平(LPO)，因此MDA已被作為氧化脅迫的一個生物標(biāo)識。高

5、溫和低溫脅迫下桔小實蠅體內(nèi)的MDA含量都較對照27℃顯著升高，說明熱脅迫打破了桔小實蠅體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的平衡，誘導(dǎo)了體內(nèi)抗氧化酶活性增強(qiáng)。桔小實蠅遭受熱脅迫后，其體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活性顯著升高，催化體內(nèi)因氧化脅迫而產(chǎn)生的高濃度超氧陰離子(O2°-)發(fā)生歧化反應(yīng)生成過氧化氫(H2O2)。隨著溫度極端升高和降低，SOD活性升高，同時隨著脅迫時間延長而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。過氧化氫酶(CAT)活性較27℃顯著增強(qiáng)，分解過量的H2

6、O2，生成對機(jī)體無害的H2O和O2，以降低體內(nèi)活性氧(ROS)的含量而緩解氧化壓力；隨著溫度極端升高和降低，CAT活性升高，同時隨著脅迫時間的延長，CAT活性也呈現(xiàn)上升后又下降的變化趨勢。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性也發(fā)生了顯著的變化，高溫脅迫下顯著升高，低溫脅迫下隨著脅迫時間的延長，GST活性下降后又快速上升并高于對照27℃下的活性；GST活性升高，分解過多的脂類過氧化物，在桔小實蠅抗熱脅迫導(dǎo)致的氧化脅迫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。過

7、氧化物酶(POD)和總抗氧化能力(T-AOC)以較高的活性值穩(wěn)定地發(fā)揮著抗氧化脅迫的作用。
　　 2.桔小實蠅在熱脅迫下的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 雙向電泳是一種對生物體內(nèi)復(fù)雜蛋白質(zhì)體系進(jìn)行高效分離的技術(shù)，分辨率高、重復(fù)性好和穩(wěn)定性強(qiáng)是其最基本的特征。蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量直接影響雙向電泳的分離效果和生物信息的完整性。本研究選擇桔小實蠅體內(nèi)的總蛋白進(jìn)行分析，建立了一套穩(wěn)定、重復(fù)性好的雙向電泳技術(shù)體系，全面挖掘桔小實蠅響應(yīng)抗熱脅

8、迫反應(yīng)的功能蛋白：通過在常規(guī)裂解液中引入2M硫脲提高了蛋白質(zhì)特別是疏水蛋白的溶解性；繼而利用蛋白質(zhì)純化試劑盒純化獲得了高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品；在膠條平衡緩沖液中增加了甘油和SDS的含量提高了平衡效果；PAGE凝膠經(jīng)質(zhì)譜兼容的銀染方法染色，最終獲得了高分辨率的雙向電泳圖譜。上述雙向電泳技術(shù)體系的建立為分離和鑒定桔小實蠅抗熱脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)奠定了堅實基礎(chǔ)。
　　 利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對桔小實蠅抗熱脅迫的響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究。將試蟲在40℃高溫

9、和0℃低溫下脅迫3h后，提取總蛋白質(zhì)，使用pH3～10、17cm的膠條和10％SDS-PAGE凝膠進(jìn)行雙向電泳。經(jīng)PDQuest V8.0.1軟件分析，三組雙向電泳圖譜具有較高的匹配率。使用PDQuest自動匹配功能，結(jié)合人工增加和去除蛋白點(diǎn)，以27℃為對照，確定了61個差異較大的蛋白質(zhì)。在熱脅迫中表達(dá)一致的有37個，其中上調(diào)30個，下調(diào)7個。經(jīng)MALDI-TOF-TOF串聯(lián)質(zhì)譜測序分析，成功鑒定出40個蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中含有15個與

10、氧化還原相關(guān)的酶類蛋白，如Superoxide dismutase、Peroxiredoxin1、Cytochrome P450和Respiratory-chainNADH dehydrogenase等；有8個各類離子和代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)移酶，如Peptide-O-fucosyltransferase、Glutathione S-transferase和Guanidophosphotransferase等；還有各種激酶和線粒體糖蛋白以及熱激蛋

11、白Hsps等。
　　 3.桔小實蠅熱激蛋白基因克隆、序列分析和mRNA表達(dá)模式解析
　　 利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆獲得了4條Hsps編碼基因，其中1條Hsp90家族基因BdHsp901，2條Hsp70家族基因BD1和BD2，1條Hsp60家族基因Hsp60；并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載其他昆蟲的Hsps氨基酸序列，采用軟件MEGA4.0用鄰接法(Neighbor-joining method，N-J法)構(gòu)

12、建了上述4條桔小實蠅Hsps基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了它們的分類關(guān)系；以桔小實蠅的actin基因(GenBank登錄號L12254)為內(nèi)參，采用實時熒光定量qPCR技術(shù)測定了這4個Hsps蛋白質(zhì)編碼基因在熱脅迫下的mRNA表達(dá)模式。
　　 桔小實蠅Hsp90家族基因BdHsp901的全長cDNA序列在GenBank中的登錄號為JN168997。該基因全長2621bp，開放閱讀框2148bp，編碼715個氨基酸。具有1個Hsp9

13、0家族簽名序列(signature)YSNKEIFLRE，根據(jù)C-端基序MEEVD確定其為胞質(zhì)型熱激蛋白。從建立的系統(tǒng)發(fā)育樹中發(fā)現(xiàn)，BdHsp901編碼的氨基酸序列和地中海實蠅Ceratitis capitata的關(guān)系最近，它們最先聚為一支，然后與刺舌蠅Glossina morsitans聚為一支，而與鱗翅目的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。高溫脅迫3h后，BdHsp901的表達(dá)顯著上調(diào)，說明桔小實蠅通過體內(nèi)大量積累該基因編碼的蛋白質(zhì)以適應(yīng)來自環(huán)境高溫的

14、脅迫壓力。Hsp90家族熱激蛋白是生物體內(nèi)含量最高的蛋白之一，但低溫脅迫只有在極端低溫-5℃誘導(dǎo)3h后才發(fā)生了顯著上調(diào)，這說明在其他的低溫下體內(nèi)BdHsp901正常的高含量足以保護(hù)細(xì)胞不受脅迫傷害。
　　 兩個Hsp70家族熱激蛋白BD1和BD2在GenBank中的登錄號分別是GU591408和GU591409。BD1基因cDNA全長2086 bp，開放閱讀框1962 bp，編碼653個氨基酸，具有3個Hsp70家族簽名序列ID

15、LGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKVQR。BD2基因cDNA全長2258 bp，開放閱讀框1911 bp，編碼636個氨基酸，具有2個Hsp70家族簽名序列IDLGTTYS和IFDLGGGTFDVSIL。兩者都具有非細(xì)胞器基序RARFEEL、C-端高度保守的細(xì)胞質(zhì)Hsps基序EEVD以及雙組份細(xì)胞核定位信號KK和RRLRT。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果分析表明，兩個Hsp70家族基因都與雙翅目實蠅類害蟲關(guān)系較近。高溫

16、脅迫后BD1表達(dá)量有所下調(diào)，而BD2的表達(dá)顯著上調(diào)，說明BD2與桔小實蠅抗熱脅迫有直接關(guān)系，而BD1可能是在其他生理活動中發(fā)揮作用。
　　 克隆獲得的Hsp60家族熱激蛋白Hsp60在GenBank中的登錄號為JF812645，基因cDNA全長2042 bp，開放閱讀框1722 bp，編碼573個氨基酸，具有分子伴侶Chaperonins cpn60的簽名序列AAVEEGIVPGGG。含有典型的頂區(qū)、赤道區(qū)和中間區(qū)三個區(qū)域和兩個

17、ATP/ADP結(jié)合位點(diǎn)以及一個Mg2+結(jié)合位點(diǎn)和一個底物結(jié)合位點(diǎn)，C-端有Hsp60家族特有的(GGM)n重復(fù)區(qū)域。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，Hsp60和包括果蠅類的雙翅目害蟲關(guān)系較近。熱脅迫后Hsp60基因mRNA表達(dá)量顯著升高，說明它參與了桔小實蠅抗熱脅迫反應(yīng)并發(fā)揮著重要的作用。
　　 4.桔小實蠅抗氧化酶基因的克隆、序列分析和mRNA表達(dá)模式解析
　　 利用桔小實蠅轉(zhuǎn)錄組序列信息，通過RACE技術(shù)，克隆獲得了1條過氧化物

18、酶(POD)的全長cDNA序列，命名為BdpoxAl，在GenBank中的登錄號JN003585。BdpoxAl基因cDNA全長2549 bp，開放閱讀框2106 bp，編碼701個氨基酸，具有1個活性位點(diǎn)、1個過度穩(wěn)定位點(diǎn)和6個金屬(鈣)特征位點(diǎn)以及4個二硫化物特征序列區(qū)域。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，它首先和麗蠅蛹金小蜂Nasonia vitripennis聚為一支，然后又與雙翅目的致倦庫蚊Culex quinquefasciatus聚在一

19、起。由此推斷，桔小實蠅與麗蠅蛹金小蜂較近的親緣關(guān)系可能是麗蠅蛹金小蜂在和寄主麗蠅類昆蟲的協(xié)同進(jìn)化中，基因發(fā)生了趨異進(jìn)化，從而更有利于自身對麗蠅類昆蟲的寄生。測定結(jié)果表明，熱脅迫后的BdpoxAl的mRNA表達(dá)量和酶活性的表達(dá)量變化趨勢一致，即35℃條件下表達(dá)上調(diào)，其他各溫度條件下都略微下調(diào)，這說明BdpoxAl編碼的過氧化物酶可能是一種組成性的蛋白質(zhì)，不論是在逆境還是正常條件下，都能穩(wěn)定地分解桔小實蠅體內(nèi)的H2O2。
　　 同樣

20、的方法克隆得到一條超氧化物歧化酶(SOD)的全長cDNA序列Bdsodl，它在GenBank中的登錄號為JQ713828。Bdsodl基因cDNA全長946 bp，開放閱讀框807 bp，編碼268個氨基酸，具有1個Cu/Zn SOD簽名序列GNAGERIACGII和6個活性位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，Bdsodl和地中海實蠅聚為一支，具有較近的親緣關(guān)系，這與傳統(tǒng)上的分類關(guān)系是一致的。在熱脅迫下，Bdsodl mRNA表達(dá)水平上調(diào)，結(jié)合酶

21、活性的升高，表明更多的超氧化物歧化酶催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，充分反映了SOD在桔小實蠅抗熱脅迫響應(yīng)中的重要意義。
　　 綜上所述，本研究基于全球氣候變暖這一特點(diǎn)，圍繞生物和環(huán)境溫度變化之間的關(guān)系，以重要果蔬害蟲桔小實蠅為研究對象，從生理生化和分子生物學(xué)水平全面、系統(tǒng)地研究了環(huán)境極端溫度對桔小實蠅的影響以及桔小實蠅抗環(huán)境熱脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制。首先，通過研究桔小實蠅在熱脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)的活性變化，明確了抗氧化酶的作用機(jī)制。其次，

22、在成功建立桔小實蠅成蟲總蛋白雙向電泳技術(shù)體系的基礎(chǔ)之上，通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，明確了在熱脅迫下桔小實蠅體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化模式和表達(dá)水平，并確定了主要的響應(yīng)蛋白質(zhì)的種類和功能。最后，克隆了相關(guān)的4條熱激蛋白Hsps和2條抗氧化酶基因全長cDNA序列，并利用實時定量qPCR技術(shù)探討了它們在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)模式，揭示了它們在桔小實蠅抗熱脅迫反應(yīng)中的作用機(jī)制。本研究綜合運(yùn)用昆蟲生理生化和分子生物學(xué)前沿技術(shù)，特別是差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，全面