農(nóng)桿菌介導EPSPS抗草甘膦基因轉化馬鈴薯品種.pdf

1、本研究所用外植體為馬鈴薯品種費烏瑞它的脫毒微型薯，利用農(nóng)桿菌介導法將EPSPS抗草甘膦基因導入馬鈴薯，經(jīng)PCR、PCR-Southern和Southern檢測，證明EPSPS基因已轉入馬鈴薯基因組中。經(jīng)RT-PCR檢測，證明EPSPS基因在馬鈴薯基因組中能夠正常轉錄。試驗建立了高效的馬鈴薯再生體系和遺傳轉化體系，同時對遺傳轉化影響因素中的：激素種類與濃度、脫菌抗生素的種類與濃度、共培養(yǎng)時間、篩選方式等進行了優(yōu)化研究。通過了對抗性植株的抗

2、草甘膦測定，初步驗證了轉基因馬鈴薯對草甘膦表現(xiàn)出抗性。主要研究結果如下：
　　 1)確定了適宜于馬鈴薯品種費烏瑞它的薯塊再生培養(yǎng)基為MS+1mg/L IAA+4mg/LZT。
　　 2)確定了農(nóng)桿菌濃度為OD600=0.5，侵染時間為6 min時，薯片出芽率為72.43％，污染率為8.7%。
　　 3)共培養(yǎng)時間對愈傷組織誘導率影響很大，薯片最佳共培養(yǎng)時間為3d。
　　 4)對不同的脫菌抗生素的濃度進行了

3、比較試驗，羧芐青霉素對含EPSPS基因的農(nóng)桿菌有效抑菌濃度是450mg/L，國產(chǎn)哈藥頭孢噻肟鈉的有效抑菌濃度是450mg/L，進口Invirogen頭孢噻肟鈉的有效抑菌濃度是150mg/L。
　　 5)試驗采用的抗性選擇劑是草丁膦(PPT)，篩選方式為延遲5d篩選，結果表明薯片芽誘導階段PPT濃度為6 mg/L，生根階段的PPT濃度為4 mg/L。
　　 6)試驗獲得抗性植株38株，經(jīng)PCR檢測有17株呈陽性，進一步的P

4、CR-Southern雜交出現(xiàn)10株陽性信號，初步表明EPSPS基因已經(jīng)整合到馬鈴薯基因組中。隨機選取7株PCR-Southern雜交陽性植株進行RT-PCR，有6株擴增出陽性條帶，說明外源基因在轉基因植株中能夠轉錄，最后通過Southern雜交出現(xiàn)5株陽性信號，進一步證明了EPSPS基因已經(jīng)整合到馬鈴薯基因組中。
　　 7)對T1代5株轉基因植株進行了PCR檢測，獲得陽性植株4株，并對其進行草甘膦抗性鑒定結果表明轉EPSPS基