轉(zhuǎn)hrf2基因油菜抗病防衛(wèi)研究及其基于高通量測(cè)序技術(shù)的全基因組表達(dá)譜分析.pdf

1、油菜是一種重要的油料作物，但在生產(chǎn)過(guò)程中常常受到油菜菌核病的為害，嚴(yán)重影響其品質(zhì)并降低產(chǎn)量。隨著植物基因工程的發(fā)展，大量的優(yōu)良抗性基因被轉(zhuǎn)入油菜中，提高其對(duì)菌核病的抗性。Harpin蛋白作為一種激發(fā)子，能夠誘導(dǎo)植物多種反應(yīng)，如過(guò)敏反應(yīng)(Hypersensitive Reaction，HR)、系統(tǒng)獲得抗病性(SAR)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)及增強(qiáng)植物抗蟲(chóng)性、抗旱性以及改善農(nóng)作物品質(zhì)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室將HarpinXooc的編碼基因hrf2，

2、通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）揚(yáng)油4號(hào)（簡(jiǎn)稱(chēng)Y4），獲得16株抗性再生T0代植株。通過(guò)T1、T2代轉(zhuǎn)基因油菜的選育工作，從T2代植株中選擇了24株P(guān)CR檢測(cè)呈陽(yáng)性且具有優(yōu)艮抗病性的轉(zhuǎn)基因植株作為T(mén)3代選育材料。采用PCR檢測(cè)、RT-PCR分析以及蛋白活性驗(yàn)證確定了hrf2已經(jīng)整合到油菜基因組中并且能夠在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)。T3代植株P(guān)CR擴(kuò)增hrf2基因呈陽(yáng)性株率為86％,其中株系T3-1-19-5

3、、T3-1-21-2、T3-3-19-12、T3-3-27-9、T3-3-22-5、T3-4-22-6中所有植株檢測(cè)均為陽(yáng)性植株。與受體植株相比，T3代轉(zhuǎn)基因植株24個(gè)株系中，23個(gè)株系對(duì)油菜菌核病表現(xiàn)出顯著抗病性。田間調(diào)查，T3代轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)穩(wěn)定:與受體植株相比，株高降低，莖基部直徑增粗，每角粒數(shù)減少，千粒重和單株產(chǎn)量增加。此外，DAB染色和H2O2的含量測(cè)定結(jié)果顯示，HarpinXooc在轉(zhuǎn)基因油菜中的表達(dá)能夠調(diào)控病原菌

4、侵染不同階段(0hpi、6hpi、12hpi、24 hpi)活性氧的積累。在正常生理?xiàng)l件下以及病原菌侵染早期(0hpi、6hpi)，與受體植株相比，轉(zhuǎn)基因油菜T-4中快速積累了大量的活性氧，并且H2O2保持了一個(gè)較高的水平;然而，在病原菌侵染后期(12h、24h)，轉(zhuǎn)基因油菜T-4反而降低了活性氧產(chǎn)生速度，以防止過(guò)多的ROS積累對(duì)植物細(xì)胞造成傷害。并且，在病原菌侵染前后不同階段，在HarpinXooc蛋白調(diào)控活性氧爆發(fā)的過(guò)程中，伴隨著R

5、OS產(chǎn)生酶編碼基因（如NAPDH、AOS）的顯著上調(diào)表達(dá)以及ROS清除酶活性的顯著提高，分別對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株T-4中H2O2較高的積累以及過(guò)多ROS的有效清除起到了重要作用。此外，轉(zhuǎn)hrf2基因油菜的抗病性同時(shí)伴隨著大量防衛(wèi)相關(guān)基因（如NPRI、OXO、PR-1、PFD1.2）的高水平表達(dá)。因此，轉(zhuǎn)基因油菜的抗病性是HarpinXooc蛋白在植物體內(nèi)介導(dǎo)的多種防衛(wèi)反應(yīng)的結(jié)果。
　　 HarpinXooc在植物體內(nèi)的表達(dá)，賦予了轉(zhuǎn)基

6、因油菜對(duì)油菜菌核病產(chǎn)生良好的抗病性以及優(yōu)良的農(nóng)藝性狀。為了更好的解析Harpin蛋白在植物體內(nèi)調(diào)控的分子作用機(jī)制，本研究中，采用基于高通量測(cè)序技術(shù)的數(shù)字基因表達(dá)譜方法，與受體植株Y4相比，分析轉(zhuǎn)基因油菜T-4的全基因組表達(dá)譜。首先，將來(lái)源于轉(zhuǎn)基因植株T-4和受體植株Y4的兩個(gè)樣品制備標(biāo)簽文庫(kù)，隨后進(jìn)行Illumina測(cè)序。測(cè)序質(zhì)量評(píng)估結(jié)果顯示，所制備的樣品標(biāo)簽庫(kù)質(zhì)量很好，只含有極少雜質(zhì)標(biāo)簽。測(cè)序飽和度分析表明，當(dāng)測(cè)序量達(dá)到3M以上時(shí)，轉(zhuǎn)

7、基因油菜T-4和受體植株Y4檢測(cè)到的基因數(shù)已經(jīng)趨于飽和。因此，本研究能夠檢測(cè)出樣品中幾乎全部的表達(dá)基因，為繪制出完整的轉(zhuǎn)hrf2油菜全基因組表達(dá)譜提供保障。Clean tag拷貝數(shù)分布統(tǒng)計(jì)顯示，兩個(gè)樣品中大部分基因是低拷貝的，符合mRNA表達(dá)的不均一特征，說(shuō)明兩個(gè)樣品Clean tag數(shù)據(jù)的合理性。將兩樣品的Clean tag根據(jù)指定的油菜參考基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)統(tǒng)計(jì)和基因表達(dá)注釋?zhuān)Y(jié)果顯示，對(duì)于轉(zhuǎn)基因油菜T-4在允許最多一個(gè)堿基錯(cuò)配的情

8、況下，唯一比對(duì)到一個(gè)基因的標(biāo)簽分別占總標(biāo)簽數(shù)和標(biāo)簽種類(lèi)數(shù)的39.73％和25.76％;受體植株Y4在允許最多一個(gè)堿基錯(cuò)配的情況下，唯一比對(duì)到一個(gè)基因的標(biāo)簽分別占總標(biāo)簽數(shù)和標(biāo)簽種類(lèi)數(shù)的36.66％和24.83％?？梢钥闯?，由于油菜物種（Brassica napus L.）的全基因組測(cè)序結(jié)果并未公布和指定的參考基因數(shù)據(jù)庫(kù)的局限性，給表達(dá)譜數(shù)據(jù)的基因注釋帶來(lái)了限制。最終，與受體植株Y4相比，在轉(zhuǎn)基因油菜T-4葉片中得到2114個(gè)差異表達(dá)基因。

9、這些差異表達(dá)基因涉及116個(gè)生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plantsignal transduction)、苯基丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、植物與病原菌互作(Plant-pathogen interaction)、能量代謝(Energy metabolism)、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、植物生理調(diào)節(jié)（Circadian

10、 rhythm-plant）、植物氧化還原代謝（Oxidative-reductive metabolism）、編程細(xì)胞死亡(Programmed celldeath)等等。我們選擇10個(gè)基因進(jìn)行Real-time PCR分析，結(jié)果表明與表達(dá)譜數(shù)據(jù)的表達(dá)量變化一致，證明了表達(dá)譜數(shù)據(jù)的可靠性。此外，針對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜T-4中2114個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析，主要關(guān)注涉及植物防衛(wèi)反應(yīng)(Plant defense response)、植物激素（

11、Plant hormone）、活性氧產(chǎn)生和清除酶類(lèi)（ROS production and scavengingenzymes）、植物信號(hào)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant signal and signal transduction）、轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor）等五大方面的相關(guān)基因。綜上，在正常生理?xiàng)l件下，Harpin在植物體內(nèi)的表達(dá)介導(dǎo)了大量涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)答生物和非生物脅迫等相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)模式的變化。我們