豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結構蛋白Nsp7間接ELISA抗體檢測試劑盒的研制與應用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)可引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病。PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，編碼13個非結構蛋白（Nsp1α，Nsp1β～Nsp12）和6個結構蛋白(GP2、GP3、GP4、GP5、M、N)。豬體感染PRRSV14天后就可以產(chǎn)生針對Nsp7的抗體，而且抗體水平很高，與N蛋白抗體水平相似，但比

2、N蛋白抗體持續(xù)時間更長。本研究通過基因重組技術獲得Nsp7大腸桿菌重組蛋白，成功構建PRRSV Nsp7間接ELISA抗體檢測試劑盒，用于PRRSV免疫抗體的檢測和血清學調(diào)查，具體內(nèi)容如下:
　　 1.PRRSV Nsp7基因大腸桿菌表達載體構建與穩(wěn)定性研究
　　 采用PCR方法從重組質粒pMD-18T-SY0608-Nsp7中擴增獲得Nsp7全基因，其大小為777bp，將其克隆至原核表達載體pET-28a，成功構建重組

3、表達質粒pET-28a-Nsp7，并轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導、SDS-PAGE和Western blot鑒定，獲得大小約為35KD重組蛋白Nsp7。將重組質粒再次轉化大腸桿菌，隨機挑取10個陽性克隆菌進行PCR檢測，結果都能擴增出特異性條帶，隨機挑取3個重組表達菌進行誘導表達，結果都能表達出35KD的重組Nsp7蛋白。將重組表達菌連續(xù)傳代30代，于第5、10、20和30代分別進行誘導表達，均能表達重組Nsp7蛋

4、白，表達產(chǎn)物均能被Nsp7單抗識別，具有良好的免疫原性，表明該重組載體具有較好穩(wěn)定性.
　　 2.PRRSV重組Nsp7蛋白抗原制備與質量檢測
　　 對重組陽性菌誘導表達條件進行優(yōu)化，在最佳誘導表達條件下大量表達重組Nsp7蛋白，用Ni-NTA親和層析方法進行純化，并對其質量進行檢測，結果為:重組Nsp7蛋白最佳誘導表達條件為:菌液起始誘導濃度OD600nm為0.8，加入終濃度為1.0mM的IPTG在37℃誘導6h。純化

5、后獲得的重組Nsp7蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳方法鑒定，在35KD處有明顯的表達帶，無明顯的雜帶。用分光光度計測定純化的重組Nsp7蛋白濃度，三批重組蛋白平均濃度分別為0.354mg/mL、0.327mg/mL和0.299mg/mL。經(jīng)ELISA檢測，三批重組蛋白的抗原包被濃度均為0.40μg/mL。
　　 3.PRRSV陰性和陽性對照血清的制備與質量檢測
　　 選用PRRSV SY0608毒株第40代病毒液，人工感染4

6、周齡的健康仔豬（抗體檢測試劑盒檢測為PRRSV、PCV2、CFSV、PRV抗體陰性）制備陽性血清。當ELISA方法檢測效價達到1∶640以上，無菌采血，獲得的血液凝固后離心分離血清。陰性對照血清采自4周齡健康仔豬（抗體檢測試劑盒檢測為PRRSV、PCV2、CFSV、PRV抗體陰性），ELISA方法檢測S/P值＜0.4，無菌采血，獲得的血液凝固后離心分離血清。鑒此制備30份陰性對照血清和15份陽性對照血清，經(jīng)過性狀檢驗、無菌檢驗、PRRS

7、V抗體檢驗和其它常見豬病原抗體檢驗均合格。
　　 4.PRRSV非結構蛋白Nsp7間接ELISA檢測方法的建立
　　 用純化的PRRSV重組Nsp7蛋白包被ELISA酶標板，建立間接ELISA抗體檢測方法，對其反應條件進行優(yōu)化，并與IDEXX公司的PRRSV抗體檢測試劑盒進行敏感性、特異性和符合率比較。結果為:抗原最適包被濃度為0.4μg/mL，37℃包被2h，封閉劑為1％BSA，封閉時間為37℃3h，待檢血清作用時間為

8、1h，酶標SPA的最佳稀釋倍數(shù)為1∶20，000，37℃作用30min，底物最佳反應時間為37℃作用10min。采用S/P比值作為判定標準，設定陰、陽性對照，根據(jù)公式計算S/P值，如果S/P≥0.4，判為陽性;如果S/P＜0.3，則判為陰性。該ELISA方法與PCV2、PRV、CSFV、HPS、EMCV、FMD等其它豬病病原抗體沒有交叉反應，與IDEXX公司的PRRSV抗體檢測試劑盒比較，其敏感性、特異性及符合率分別為90.0％、95.

9、0％和92.0％。
　　 5.PRRSV非結構蛋白Nsp7間接ELISA抗體檢測試劑盒組裝與質量檢測
　　 采用3批純化重組Nsp7蛋白，制備酶標板，確定保存方法，并分別檢測30份PRRSV抗體陰性血清，確定陰性對照血清和陽性對照血清及其保存期，組裝3批PRRSV抗體檢測試劑盒，進行敏感性、特異性和重復性測定。結果為:3批試劑盒與IDEXX公司PRRSV抗體檢測試劑盒分別檢測30份陽性血清，其相對敏感性分別為93.3％、

10、93.3％和90.0％。檢測10份陽性血清，抗體效價均達1∶640。3批試劑盒同時檢測PRRSV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、副豬嗜血桿菌（HPS）、豬口蹄疫病毒(FMD)和豬腦心肌炎病毒(EMCV)等病原的陽性血清，結果除了PRRSV血清檢測為陽性外，其它病原的陽性血清的檢測結果均為陰性;同時檢測30份陰性血清，結果均為陰性。3批試劑盒進行批次內(nèi)和批次間重復性試驗，批次內(nèi)的變異系數(shù)在3.

11、39％～8.27％，批次間的變異系數(shù)在0.47％～7.30％，其值均小于10％。試劑盒在4℃至少可保存8個月。以上結果表明該試劑盒具有較高敏感性、特異性和重復性，可用于PRRSV抗體檢測。
　　 6.PRRSV非結構蛋白Nsp7間接ELISA抗體檢測試劑盒的應用
　　 用試制的試劑盒與IDEXX公司PRRSV抗體檢測試劑盒同時檢測168份臨床豬血清，兩者陽性符合率為91.4％，陰性符合率為96.6％，總符合率為92.3％

12、。用PRRSV活疫苗（R98株）免疫PRRSV陰性健康仔豬，免疫后不同時間分別檢測Nsp7抗體和N蛋白抗體產(chǎn)生規(guī)律，結果為:PRRSV R98疫苗免疫后2W，可檢出Nsp7抗體，并逐漸升高，維持至少100天，而N蛋白抗體產(chǎn)生時間較早，免疫后1W即可產(chǎn)生，維持至70～100天，兩者抗體水平基本一致。采用本試劑盒檢測996份臨床血清的PRRSV抗體，結果為PRRSV血清抗體陽性率為77.21％。以上結果表明本試劑盒可用于PRRSV免疫抗體監(jiān)