江西省豬痘病毒的分離及其分子流行病學(xué)和血清學(xué)調(diào)查.pdf

1、豬痘(Swinepox)是由豬痘病毒(Swinepox virus，SWPV)引起豬的一種溫和或急性傳染病，以皮膚發(fā)生紅斑、丘疹、膿皰和結(jié)痂為特征，主要危害3月齡以內(nèi)的豬，成年豬很少發(fā)生或癥狀輕微，也有關(guān)于豬痘病毒胎盤感染導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎或初生仔豬發(fā)病的報(bào)道，呈世界性分布。豬痘可通過豬虱等的叮咬機(jī)械傳播，與豬的飼養(yǎng)衛(wèi)生條件差相關(guān)。由于豬痘給養(yǎng)豬業(yè)造成的直接損失較小，通常被忽視。本試驗(yàn)通過豬痘病毒的分離及其分子流行病學(xué)和血清學(xué)調(diào)查，旨在了解

2、江西地區(qū)豬群中豬痘病毒的感染情況，為今后開展豬痘的流行病學(xué)、病毒的生物學(xué)特性、豬痘病毒作為表達(dá)載體等的研究打下基礎(chǔ)。
　　1.豬痘病毒PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　根據(jù)GenBank上登錄的豬痘病毒(登錄號(hào)：AF410153.1)P35基因序列，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)引物，擴(kuò)增目的片段為975bp。以疑似豬痘的皮膚痘痂提取DNA，通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)豬痘病毒PCR方法。特異性、重復(fù)性和敏感性試驗(yàn)表明，該方法特異性高、重

3、復(fù)性良好、對(duì)模板的最低檢測(cè)量為2.7×10-8μg。以建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)收集自江西地區(qū)的55份疑似豬痘保育豬皮膚痘痂進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果有44份為豬痘病毒陽性，陽性率為80％，表明江西省豬群存在豬痘病毒感染。
　　2.豬痘病毒分離及P35基因的同源性分析
　　以PCR檢測(cè)為豬痘病毒陽性的保育豬皮膚痘痂為病毒分離材料，采用PK15細(xì)胞盲傳方式進(jìn)行豬痘病毒的分離，通過對(duì)PK15細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行豬痘病毒P35基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)

4、序確定病毒分離的成功。從江西省分離到15株豬痘病毒，分別命名為SWPV-JX01～SWPV-JX15。所有分離毒株在PK15細(xì)胞上均不產(chǎn)生明顯的CPE，感染的PK15細(xì)胞均能連續(xù)傳代，僅造成死細(xì)胞偏多、胰酶消化時(shí)間縮短。以分離株SWPV-JX07人工感染兔和小鼠試驗(yàn)，表明能在兔體內(nèi)增殖，不能在小鼠體內(nèi)增殖。通過對(duì)分離毒株P(guān)35基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果表明：(1)分離毒株間的核苷酸序列同源性為98.1％～

5、100％，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為98.2％～100％；(2)分離毒株與豬痘病毒(AF410153.1)的P35基因核苷酸序列同源性為96.6％～98.2％，氨基酸序列同源性為87.5％～88.5％。
　　3.豬痘病毒P35基因的原核表達(dá)
　　將豬痘病毒P35基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-P35，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明，表達(dá)

6、產(chǎn)物分子量約為64kDa(GST蛋白26kDa，P35蛋白約38kDa)，與預(yù)期大小一致；通過蛋白純化和濃度測(cè)定，獲得濃度約700μg/mL P35重組蛋白；以純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠(70μg/次·只)，連續(xù)免疫三次后采血，抗體效價(jià)達(dá)到1:102400，表明該P(yáng)35重組蛋白具有良好的免疫原性。
　　4.豬痘病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及江西地區(qū)豬痘病毒血清學(xué)調(diào)查
　　以P35重組蛋白為檢測(cè)抗原包被96孔酶

7、標(biāo)板，建立了檢測(cè)豬血清中豬痘病毒抗體的間接ELISA方法，該方法的最佳包被抗原濃度為10μg/mL，豬血清最佳稀釋度為1:80，兔抗豬IgG酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為1:5000。以建立的ELISA方法對(duì)2006年～2012年江西地區(qū)258個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)的2530豬血清樣品進(jìn)行豬痘病毒抗體檢測(cè)，結(jié)果.1045份為豬痘病毒抗體陽性，血清總陽性率為41.3％(1045/2530)；豬場(chǎng)陽性率為90.7％(234/258)；其中母豬、哺乳仔豬、保育豬和生