禽與豬戊型肝炎病毒衣殼蛋白抗原性分析.pdf

1、戊型肝炎(HepatitisE，HE)是一種由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)引起的急性病毒性肝炎。HEV主要經(jīng)消化道，以糞口途徑為最主要的傳播方式。HEV既可以在一些公共衛(wèi)生條件較差的不發(fā)達(dá)國家引起大規(guī)模的暴發(fā)流行，也可以在發(fā)達(dá)國家引起急性散發(fā)性發(fā)疾病，我國是HE的主要流行區(qū)之一。
　　 HEV屬于肝炎病毒屬，為無囊膜，單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約為7.2Kb，比禽HEV基因組全長多600bp左右，

2、含有3個(gè)開放閱讀框(Openreadingframe，ORF)，分別為ORF1、ORF2和ORF3。其中ORF2編碼衣殼蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，并且包含病毒主要的抗原表位。本文通過原核表達(dá)禽和豬HEV的衣殼蛋白，了解該蛋白的抗原性，從而為該病毒的診斷和預(yù)防等提供材料和理論支持。
　　 1.禽HEV衣殼蛋白抗原性分析
　　 以中國禽HEV(GenBankaccessionN0.GU954430)分離株的病毒懸液為模板，設(shè)

3、計(jì)引物原核表達(dá)衣殼蛋白N端ORF2-A(23-358aa)和C端ORF2-B(339-606aa)蛋白。通過免疫BALB/c小鼠，在免疫方法、免疫劑量和檢測方法均相同的情況下，免疫ORF2-A蛋白的小鼠五免后抗體水平勉強(qiáng)等同于免疫ORF2-B蛋白的小鼠三免后的抗體水平；同時(shí)，在對收集的1379份來自不同地區(qū)臨床雞血清的檢測中，發(fā)現(xiàn)502份(36.4％)臨床血清含ORF2-B抗體，僅331(24％)臨床血清針對ORF2-A抗體陽性，其中1

4、43份(10.4％)份含ORF2-A抗體而不含ORF2-B抗體。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，禽HEV衣殼蛋白的C端和N端區(qū)域的抗原性存在明顯差異，并且其C端區(qū)域的免疫反應(yīng)原性強(qiáng)于其N端區(qū)域。
　　 隨后利用抗原性分析軟件DNAStar將ORF2-A蛋白分為相互重疊的4段區(qū)域，然后原核表達(dá)，利用分段的蛋白檢測免疫小鼠血清和臨床ORF2-A抗體陽性雞血清，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)衣殼蛋白的N-端區(qū)域的主要抗原區(qū)位于23-84aa之間。
　　 2.

5、豬HEV衣殼蛋白C端區(qū)域單克隆抗體的制備及鑒定
　　 以山東省豬HEV分離株的病毒懸液為模板，設(shè)計(jì)引物獲得與禽HEV的ORF2-B蛋白對應(yīng)的基因序列，并進(jìn)行原核表達(dá)獲得蛋白(ORF2-S)。蛋白純化后免疫BALB/c小鼠，經(jīng)常規(guī)的細(xì)胞融合和亞克隆制備出3株特異性針對豬HEVORF2-S蛋白的單克隆抗體(1E4，2C7，2G9)。單抗與臨床收集的豬血清競爭ELISA發(fā)現(xiàn)，1E4和2G9能夠阻斷臨床陽性豬血清，提示該兩株單克隆抗體識

6、別的抗原表位是豬HEV衣殼蛋白上重要的抗原表位區(qū)，而單抗Mab-2C7不能阻斷。衣殼蛋白單克隆抗體的制備為豬HEV的診斷及研究提供重要工具。
　　 3.禽與豬HEV衣殼蛋白共有抗原表位分析
　　 利用制備的6株抗禽HEV衣殼蛋白的單抗以及3株抗豬HEV衣殼蛋白的單抗分別與禽、豬HEV衣殼蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)抗禽HEV的單抗185與3E8識別的表位為禽、豬HEV所共有，其共有抗原表位位于禽HEV衣殼蛋白C端335-383