激活NF-κB信號(hào)通路的高致病性PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白的篩選及其作用機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬繁殖障礙、仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的一種新發(fā)性病毒傳染病。PRRSV基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，可編碼14種非結(jié)構(gòu)蛋白和7種結(jié)構(gòu)蛋白，其中Nsp2是分子量最大且最易發(fā)生變異的一個(gè)病毒編碼蛋白。
　　 2006年，由PRRSV變異株引起的高致病性PRRS在我國(guó)大規(guī)模暴發(fā)，造成上百萬(wàn)頭豬死亡，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。與

2、傳統(tǒng)的PRRSV毒株相比，高致病性PRRSV毒株能夠引起更強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和更高的死亡率，并成為我國(guó)流行和蔓延的主要毒株。然而，目前對(duì)這種毒株感染后引起宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制知之甚少。針對(duì)這種新的PRRSV，本文開(kāi)展了對(duì)其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究，為闡明PRRSV的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容包括：
　　 1.高致病性PRRSV感染激活NF-κB信號(hào)通路的研究
　　 NF-κB是一類(lèi)具有多重轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用

3、的核蛋白因子，在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞的增殖中都有著重要的作用。利用NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)高致病性PRRSV對(duì)NF-κB的激活情況，發(fā)現(xiàn)其能顯著激活NF-κB并依賴(lài)于病毒的復(fù)制，且呈劑量依賴(lài)性。進(jìn)一步以PRRSV感染MARC-145細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TLR信號(hào)通路的關(guān)鍵接頭蛋白及重要信號(hào)分子的表達(dá)情況，對(duì)PRRSV激活NF-κB的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探究。結(jié)果表明，PRRSV能上調(diào)病原模式識(shí)別受體TLR2和TLR4以及信號(hào)分子TR

4、AF6和TAK1的表達(dá)，推測(cè)PRRSV通過(guò)同時(shí)上調(diào)模式受體TLR2和TLR4進(jìn)而上調(diào)信號(hào)分子TRAF6和TAK1的表達(dá)從而激活NF-κB信號(hào)通路；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PRRSV感染的MARC-145細(xì)胞內(nèi)TLR3和其他的信號(hào)蛋白并無(wú)顯著上調(diào)，甚至部分細(xì)胞因子在某些時(shí)間點(diǎn)還出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的趨勢(shì)。這提示著PRRSV在感染細(xì)胞內(nèi)調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)途徑的復(fù)雜性，其可能是通過(guò)多種調(diào)控策略調(diào)控NF-κB的上游信號(hào)通路，而最終導(dǎo)致NF-κB活化的。這些結(jié)果為解釋臨床上

5、PRRSV引起復(fù)雜的機(jī)體免疫反應(yīng)和強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)補(bǔ)充了有用的數(shù)據(jù)。
　　 2.激活NF-κB信號(hào)通路的高致病性PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白的篩選
　　 已有研究表明，PRRSV編碼的所有結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白能顯著激活NF-κB。為了闡明PRRSV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白在其誘導(dǎo)NF-κB活化中的作用，利用NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，對(duì)高致病性PRRSV所有非結(jié)構(gòu)蛋白激活NF-κB的能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)只有Nsp2能顯著激活NF-κB，而其他

6、的非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)NF-κB無(wú)明顯激活。
　　 3.高致病性PRRSV Nsp2激活NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制研究
　　 為了解析Nsp2激活NF-κB的分子機(jī)制，首先以Nsp2的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)IκBβ和NF-κB下游炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)及NF-κB p65的磷酸化和轉(zhuǎn)定位情況，發(fā)現(xiàn)Nsp2能誘導(dǎo)IκBα的降解及p65的磷酸化和轉(zhuǎn)核，并激活NF-κB下游炎癥細(xì)胞因子。進(jìn)一步利用Nsp2截短突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒，證

7、實(shí)Nsp2激活NF-κB的作用域位于高變區(qū)的180-480位氨基酸之間。通過(guò)對(duì)Nsp2跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和跨膜區(qū)缺失突變體的熒光素酶實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其C端的跨膜結(jié)構(gòu)在其細(xì)胞定位以及激活NF-κB中均發(fā)揮重要作用，推測(cè)其線粒體定位可能為其激活NF-κB所必需。進(jìn)一步利用RNA干擾實(shí)驗(yàn)和Nsp2超表達(dá)對(duì)Nsp2誘導(dǎo)NF-κB的上游信號(hào)通路進(jìn)行了探究，結(jié)果表明，接頭蛋白TLR4和信號(hào)分子TRIF、MAVS的沉默可以抑制Nsp2對(duì)NF-κB的激活；而N

8、sp2的超表達(dá)可以上調(diào)TLR4、TRIF以及TRAF2的表達(dá)。這些結(jié)果表明，PRRSV Nsp2可能是同時(shí)通過(guò)TLR4和RIG-1依賴(lài)的信號(hào)途徑激活NF-κB。由于RIG-1信號(hào)通路中的重要接頭蛋白MAVS是一個(gè)線粒體定位蛋白，而Nsp2的線粒體定位模式改變后其激活NF-κB的能力顯著降低，這說(shuō)明Nsp2與MAVS的共定位對(duì)Nsp2激活NF-κB具有重要的作用。
　　 4.Nsp2與宿主蛋白R(shí)AI相互作用激活NF-κB的研究

9、r>　　 由于病毒感染動(dòng)物機(jī)體后與宿主的相互作用是其致病的分子基礎(chǔ)，本研究又從蛋白相互作用的角度對(duì)Nsp2激活NF-κB的可能機(jī)制進(jìn)行探究。首先運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)從豬腦cDNA文庫(kù)中篩選了與PRRSV Nsp2相互作用的宿主蛋白，并選取能與p65結(jié)合從而特異性抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的宿主蛋白R(shí)AI作為深入研究的對(duì)象。進(jìn)一步，通過(guò)哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀技術(shù)、熒光共定位等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Nsp2與RAI在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的相互作用。并利用

10、截短突變體和酵母回返實(shí)驗(yàn)，確定了二者相互作用的功能域分別位于Nsp2中間的高變區(qū)和RAI的C端，由于RAI與p65的互作區(qū)域同樣位于C端，推測(cè)當(dāng)PRRSV感染細(xì)胞后，其編碼的Nsp2可能通過(guò)與RAI相互作用從而拮抗RAI對(duì)NF-κB的抑制作用，為了驗(yàn)證這一推測(cè)，利用NF-κB啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了Nsp2與RAI相互作用對(duì)NF-κB表達(dá)的影響，結(jié)果超表達(dá)RAI顯著抑制NF-κB的啟動(dòng)子活性，而同時(shí)超表達(dá)Nsp2與RAI時(shí)不影響N

11、F-κB的啟動(dòng)子活性；進(jìn)一步檢測(cè)Nsp2對(duì)RAI表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)Nsp2對(duì)RAI的表達(dá)水平無(wú)明顯影響，這表明Nsp2拮抗RAI的NF-κB抑制功能并不是通過(guò)降低其表達(dá)水平來(lái)完成的，這也進(jìn)一步證實(shí)Nsp2可能是通過(guò)拮抗RAI與p65的相互作用從而激活NF-κB的。
　　 5.PRRSV經(jīng)典株與變異株引起不同程度炎癥反應(yīng)的分子機(jī)理研究
　　 通過(guò)比較PRRSV經(jīng)典毒株CH-1a與變異毒株WUH3的Nsp2激活NF-κB的

12、能力，發(fā)現(xiàn)WUH3株的Nsp2激活NF-κB的能力顯著高于CH-1a株的Nsp2。由于變異毒株與經(jīng)典毒株Nsp2的主要差異是中間高變區(qū)內(nèi)存在30個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失，為了探究30個(gè)氨基酸的缺失是否是造成二者激活NF-κB能力差異顯著的原因，構(gòu)建了一系列Nsp2的插入和缺失突變體，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)其激活NF-κB的能力。結(jié)果顯示，1個(gè)或29個(gè)氨基酸的缺失并不是造成二者激活NF-κB能力差異的直接原因。進(jìn)一步，通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

13、對(duì)兩種毒株的Nsp2及其突變體激活I(lǐng)L-6、IL-8、RANTES等炎癥細(xì)胞因子的能力進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種毒株的Nsp2激活I(lǐng)L-6、IL-8、RANTES的能力均存在顯著差異，變異株的Nsp2的激活能力顯著高于經(jīng)典株的Nsp2，而1個(gè)或29個(gè)氨基酸的缺失并不是造成此種差異的直接原因。由于核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8、RANTES都是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，因此以上結(jié)果為解釋臨床上不同毒株引起不同程度的炎