重慶地區(qū)煙草黑脛病菌遺傳多樣性研究.pdf

1、煙草黑脛病(Phytophthora nicotianae)在我國的分布范圍很廣，破壞力極強，可以危害曬煙、烤煙、晾煙、白肋煙、香料煙等所有栽培煙草。重慶是我國重要煙區(qū)之一，煙草黑脛病發(fā)生嚴(yán)重，已造成了巨大的經(jīng)濟損失，并且防治成本不斷提高，防治難度不斷加大。煙草黑脛病菌具有豐富的遺傳多樣性，表現(xiàn)在交配型、抗藥性變異、致病力分化等方面，這使得煙草品種抗性喪失等問題突出。本文利用RAPD技術(shù)對不同遺傳背景的病原菌進(jìn)行多態(tài)性分析，為防治煙草黑

2、脛病的深入研究提供理論依據(jù)。
　　 1.菌種保存
　　 采用燕麥培養(yǎng)基25℃保存、燕麥培養(yǎng)基13℃保存、滅菌蒸餾水菌絲塊25℃保存、液體石蠟菌絲塊25℃保存等方法保存煙草黑脛病菌菌株，研究煙草黑脛病菌菌株的轉(zhuǎn)代時間和最長保存時限。其中燕麥培養(yǎng)基25℃保存每隔4個月需移植一次，保存時限在9個月左右；燕麥培養(yǎng)基斜面13℃保存方法效果稍差，保存時限也可達(dá)6個月；液體石蠟25℃保存19個月時，存活率為75％；滅菌蒸餾水菌絲塊25

3、℃保存效果最好，保持時間19個月時存活率為100％，
　　 2.標(biāo)樣采集及菌株分離、鑒定
　　 本研究2009年從重慶酉陽、石柱、涪陵采集標(biāo)樣，并分離得到煙草黑脛病菌菌株25株，2010年從重慶奉節(jié)、酉陽、南川分離得到菌株10株，加上由西南大學(xué)植物生態(tài)病理研究生提供的56個菌株，共計91株。菌株來源包括：酉陽、石柱、奉節(jié)、南川、武隆、彭水、萬州、涪陵、巫山重慶9大煙區(qū)，菌株采集時間從2005年至2010年。
　　

4、 3.交配型測定
　　 采用平板直接配對培養(yǎng)法，對重慶地區(qū)的45個菌株進(jìn)行交配型測定。2009年采集的25個菌株皆為A2交配型，未檢測到其他類型。同時檢測部分2006年采集于涪陵、酉陽、石柱、巫山的菌株，部分2007采集于酉陽的菌株。重慶市目前只發(fā)現(xiàn)A2、A0交配型，而2009年采集的菌株只有A2交配型，與之前的研究有所出入。
　　 4.抗甲霜靈水平測定及抗性菌株誘導(dǎo)
　　 測定了重慶地區(qū)29株煙草黑脛病菌菌株，

5、酉陽18個菌株的平均EC50值為0.8181μg/mL，整體抗性水平偏高；石柱8個黑脛病菌菌株平均EC50值為0.5476μg/mL，整體抗性水平較低；不同來源菌株的抗性水平存在較大差異。
　　 誘導(dǎo)高抗突變體20個，其中抗性最高的突變體是RSL1-7-1(EC50=530.5789μg/mL)，是原始菌株的941倍，誘導(dǎo)濃度5μg/mL；抗性穩(wěn)定性測定表明，突變菌株在多次轉(zhuǎn)代后抗性仍可保持穩(wěn)定；抗性突變體的適合度均低于原始菌株

6、，高抗突變體的適合度最低，然而所有突變體的適合度均保持在較高水平。
　　 5.生理小種測定
　　 菌株YBX2-1、YBX1-3、YBX3-1、FJ3-8、SS1-6、SL1-7在TTZ固體培養(yǎng)基中菌絲塊變?yōu)榧t色，排除了6個菌株是3號生理小種的可能。用鑒別寄主測定6個菌株的生理小種，結(jié)果表明僅SL1-7是0號生理小種，其余皆為1號生理小種。
　　 6.RAPD遺傳多樣性分析
　　 運用RAPD技術(shù)分析12

7、個菌株(包括原始菌株：YBX2-1、YBX1-3、YBX3-1、FJ3-8、SS1-6、SL1-7，誘導(dǎo)抗性菌株：RSL1-7-1、RYAB2-1-1、RYAB2-1-2、RYAB2-1-3、RYAB2-1-5、RYAB2-1-9)的遺傳多樣性，7個隨機引物共擴增出條帶39條，多態(tài)率51.28％。以相似系數(shù)0.86為閾值，12個菌株被分為4個遺傳聚類組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。其中抗性最高的菌株RSL1-7-1在0.74水平上，就被分為單獨一