豬圓環(huán)病毒Ⅱ型單克隆抗體的制備及抗原捕獲ELISA方法的初步建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridael)圓環(huán)病毒屬，可引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成相當大的經(jīng)濟損失。 本研究中將原核表達PCV2開放閱讀框架2(ORF2)的兩段蛋白(GST-PCV737-421；GST-PCV421-37)的重組菌pGEX-PCV737-421與pGEX-PCV421-37在含氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中進行誘導表達，收集菌液，超聲波裂解，經(jīng)聚丙烯酰胺

2、凝膠電泳(SDS-PAGE)，切下含目的蛋白的膠條，免疫BALB/c小鼠來制備單克隆抗體，經(jīng)間接免疫熒光抗體試驗(IFA)來篩選陽性克隆，再采用有限稀釋法進行亞克隆，最終得到20株陽性單克隆。采用抗體亞類鑒定試劑盒對單抗的重鏈和輕鏈進行鑒定，確定了單抗的部分生物學特性，經(jīng)IFA與WesternBlotting檢測，所得到的20株單抗中有3株細胞為PCV2型特異性地單抗，它們?yōu)?B7-B1、9B6-A7和9E2-A10，其余17株細胞為P

3、CV1與PCV2共反應單抗。將陽性單克隆擴大培養(yǎng)后注射12周齡經(jīng)產健康雌性BALB/c小鼠來采取腹水，經(jīng)IFA檢測確定效價。挑選26H5-A3與9B6-A7單抗分別來做包被抗體，初步建立抗原捕獲ELISA方法。 實驗結果表明所篩選得到的20株陽性單克隆細胞抗體分泌穩(wěn)定，所建立的抗原捕獲ELISA方法采用單抗包被，多抗夾心，能夠很好的將PCV2、PCV1與豬細小病毒(PPV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬繁殖呼吸障礙綜合征病毒(PRR