棉花(Gossypium hirsutum)WRKY基因分離與鑒定.pdf

1、棉花(Gossypium hirsutum)是世界性的重要經濟作物，在我國國民經濟中占有重要地位。棉纖維作為重要的天然纖維，是紡織工業(yè)的主要原材料，廣泛應用于紡織、造紙、生物燃料和化學工業(yè)，棉纖維品質決定了其作為商品的價值。然而，棉花經常受到諸如蟲害等生物脅迫以及高鹽、干旱、低溫、營養(yǎng)缺乏等非生物脅迫，造成棉花產量急劇下降。因此，通過基因工程手段將一些具有抗逆功能的基因導入到植物基因組中獲得抗逆新品種，將擴大植物對環(huán)境的適應性，降低逆境

2、對作物的影響。
　　WRKY蛋白家族是植物特有的轉錄因子，因其含有60個氨基酸組成的WRKY結構域而得名。該類蛋白在N端含有保守的氨基酸基序WRKYGQK，在C端含有一個新型的C2H2或C2HC鋅指基序。已有研究表明，WRKY轉錄因子在植物許多生理過程中發(fā)揮非常重要的作用，這些生理過程包括植物衰老、生長發(fā)育、生物和非生物脅迫（高溫、高鹽、干旱等）應答等。另外，植物某些器官的發(fā)育以及細胞內物質代謝，也受到WRKY蛋白的調控。但對于W

3、RKY轉錄因子是否參與調控棉纖維發(fā)育，目前尚無報道。因此，研究闡明WRKY轉錄因子在棉花防御應答中的調控機理，以及WRKY轉錄因子在棉纖維發(fā)育中的作用，將是今后的一個重要研究方向。同時，上述研究對于培育抗逆作物品種也具有重要的實踐意義。
　　我們首先對棉花cDNA文庫中隨機挑取的4000多個cDNA克隆進行測序，篩選獲得4個WRKY基因（GhWRKY31-34），定量RT-PCR分析結果表明，這4個WRKY基因均在棉花根和葉片中優(yōu)

4、勢表達。為獲得在棉纖維發(fā)育中特異或優(yōu)勢表達的WRKY基因，我們通過電子克隆的方法得到22個WRKY基因。定量RT-PCR分析結果表明，其中有2個基因(GhWRKY12/16)在棉纖維中優(yōu)勢表達。本文主要從基因結構特征分類和表達模式，以及蛋白結構特征、轉錄自激活活性和亞細胞定位等方面淺析GhWRKY基因的特性及功能表達調控等，此外也對它們在一些非生物脅迫應答中的作用進行了初步研究。獲得的主要結果如下:
　　1、26個GhWRKY基因

5、分離鑒定及其編碼蛋白的序列結構特征
　　我們首先對棉花cDNA文庫中隨機挑取的4000多個cDNA克隆進行測序，篩選獲得4個全長序列的WRKY基因(cDNA)，命名為GhWRKY31，GhWRKY32，GhWRKY33和GhWRKY34。我們進一步在棉花公共EST資料庫中篩查相關的WRKY cDNA序列，通過電子克隆的方法，獲得另外22個GhWRKY基因(cDNA)。這26個基因的開放閱讀框(open reading frame，

6、ORF)分別為495bp-1302bp，編碼蛋白長度為165-434個氨基酸。這些WRKY蛋白的氨基酸序列中均含有WRKY結構域(WRKYGQK基序)，C端具有典型的鋅指序列結構C2H2或C2HC。
　　根據GhWRKY蛋白所含有的WRKY結構域的數量和鋅指序列結構類型，可將這26個GhWRKY蛋白分為三大類，其中有5個蛋白歸屬于Ⅰ類，5個歸屬Ⅲ類，其他16個歸屬于Ⅱ類。根據Ⅱ類所含有的氨基酸不同，又可將其細分為Ⅱa，Ⅱb，Ⅱc，

7、Ⅱd和Ⅱe五個亞類。
　　2、GhWRKY基因在棉花中的表達分析
　　為研究所分離的26個WRKY基因在棉花中的表達譜，我們提取棉花不同組織的總RNA，逆轉錄為cDNA，以其為模板，進行熒光定量RT-PCR分析。結果表明，大多數GhWRKY基因均在營養(yǎng)組織中優(yōu)勢表達，尤其是在根、葉、子葉和下胚軸組織中表達量相對較高。有2個基因(GhWRKY12/16)在開花后3-10天的棉纖維中優(yōu)勢表達，表明這些基因可能在起始和伸長期的棉纖

8、維細胞中發(fā)揮一定的調控作用。
　　已有研究報道表明WRKY在非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。為研究所分離的26個WRKY基因是否也受非生物脅迫誘導，我們將在1/2MS上生長7天的棉花幼苗分別移至含有150 mM NaCl，250 mM甘露醇，100μMABA的1/2MS液體培養(yǎng)基中處理5h，然后提取其總RNA，逆轉錄為cDNA，進行熒光定量RT-PCR分析。結果表明，在棉花根中，GhWRKY14/20/24/33/34在三種脅迫處理下

9、其轉錄水平得到顯著升高，GhWRKY9/10的表達水平受ABA和甘露醇的誘導，GhWRKY11/13在NaCl和甘露醇兩種脅迫處理中，其表達量均大幅度提高。此外，GhWRKY12/15/16/21/30/32只受NaCl的誘導，GhWRKY17/29只受甘露醇的誘導，GhWRKY19/23只受ABA的誘導;在棉花子葉中，58％的GhWRKY基因在三種脅迫處理下，其表達量均受到上調;在棉花下胚軸中，僅有Gh WRKY11的表達量在三種脅迫

10、處理下得到上調，Gh WRKY11/13/16/20/24/26/29/30/33/34在ABA和NaCl處理下均上調其表達量，Gh WRKY12/31/32僅在NaCl處理下，其表達量才得到上調。綜上結果表明，在棉花生長發(fā)育中，GhWRKY基因對非生物脅迫響應的調節(jié)發(fā)揮著重要作用。
　　3、GhWRKY31/34蛋白亞細胞定位分析
　　構建了由CaMV35S啟動子驅動的GhWRKY基因與綠色熒光蛋白(eGFP)報告基因融合

11、表達載體，通過農桿菌介導的DNA轉移，利用浸花法轉化擬南芥，獲得GhWRKY31-GFP和GhWRKY34-GFP轉基因植株，用轉基因植株T2代進行表型分析。將T2代種子在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，待小苗生長5天后，在共聚焦顯微鏡下觀察轉基因擬南芥小苗根細胞的GFP熒光信號，結果表明GFP熒光信號主要積聚在細胞核內。上述結果證明GhWRKY31/34蛋白定位于細胞核。
　　4、GhWRKY蛋白轉錄自激活分析
　　為研究GhWRKY蛋

12、白是否具有轉錄自激活活性，構建了6個基因(GhWRKY12/16/31/32/33/34)的酵母表達載體(pGBKT7-GhWRKY12/16/31/32/33/34)，分別轉化酵母菌株AH109和Y187，將轉AH109的陽性單菌落分別在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His平板上劃線培養(yǎng)，同時對轉Y187陽性單菌落進行X-Gal濾紙顯色分析。結果表明GhWRKY31/33蛋白具有轉錄自激活效應，GhWRKY12/16/3

13、2/34不具有轉錄自激活效應。
　　5、過量表達GhWRKY轉基因擬南芥植株的抗鹽性分析
　　構建了過量表達GhWRKY12/31/34載體，通過浸花法轉入擬南芥，獲得這3個WRKY基因的轉基因擬南芥植株。通過多代(T1-T3代)分析表明，正常生長條件下，過量表達GhWRKY12、GhWR31和GhWRKY34的轉基因擬南芥植株生長發(fā)育正常，與野生型植株相同。通過qRT-PCR分析表明，在棉花中GhWRKY12/31/34基

14、因表達都受到鹽脅迫誘導，因而推測這3個基因可能參與了植物鹽脅迫應答過程。因此，我們分別用100、150和200 mM NaCl處理轉基因植株，統(tǒng)計種子萌發(fā)率和幼苗綠葉率、根長，測定幼苗葉片葉綠素含量以及鹽脅迫相關基因的表達變化等指標。結果表明，與野生型相比較，GhWRKY12/34轉基因擬南芥植株耐鹽性增強，而GhWRKY31轉基因擬南芥植株在種子萌發(fā)期對鹽脅迫的耐受性有所提高，但在幼苗生長期對鹽脅迫敏感。
　　6、GhWRKY轉