PRRSV感染誘導細胞自噬及內質網應激的機制研究.pdf

1、細胞自噬是一種溶酶體依賴性的降解途徑，在維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著重要作用。越來越多的研究顯示，細胞自噬在不同病毒感染的過程中扮演著不同的角色，同樣病毒對細胞自噬的調控機制也不盡相同。此外，細胞自噬還跟天然免疫存在著密切的關系。
　　 內質網是蛋白質合成的重要場所，在蛋白的翻譯和修飾過程中發(fā)揮著重要作用，病毒復制過程中往往導致大量未折疊或錯誤折疊蛋白的堆積而引起內質網應激，進而誘導未折疊蛋白反應(UPR)，UPR同樣跟病毒

2、的增殖存在重要的關系。此外，UPR可以調控細胞自噬的水平。
　　 豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)以引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為主要特征，具有較高的死亡率。盡管隨著研究的深入取得了一系列的研究成果，但針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的免疫抑制及其對細胞的具體調控機制仍不甚明了。鑒于此，本研究深入探討了PRRSV感染后自噬及內質網應激的誘導情況。主要研究內容包括:
　　 1.PRRSV感染誘導自噬體

3、的形成
　　 為確定PRRSV感染是否誘導自噬體的形成，首先通過WesternBlot的方法檢測PRRSV感染后Ⅱ型微管結合蛋白輕鏈3(LC3-Ⅱ)的表達變化，結果顯示PRRSV感染明顯誘導了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化，初步揭示了PRRSV感染可以誘導細胞自噬;進一步我們通過激光共聚焦顯微鏡觀察PRRSV感染后EGFP-LC3的定位，結果發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染MARC-145細胞后融合表達蛋白EGFP-LC3發(fā)生明顯的點狀聚集，

4、進一步證明PRRSV感染可以誘導細胞自噬;最后，通過透射電鏡對細胞的超微結構進行觀察，同時在陽性對照組及PRRSV感染組中觀察到自噬體的存在，直接證明了PRRSV感染后可以誘導自噬體的形成。
　　 2.PRRSV感染促進自噬體的降解
　　 兩種途徑可引起細胞內自噬體的聚集:細胞自噬被誘導、自噬體的降解被抑制。為驗證PRRSV感染誘導自噬體聚集的具體機制，首先通過Lyso-Tracker對溶酶體進行染色，觀察EGFP-LC

5、3與溶酶體的共定位情況，證實PRRSV感染誘導的自噬體可以與溶酶體發(fā)生共定位，初步推斷PRRSV感染能促進自噬體的降解。進一步，通過WesternBlot分別對p62的降解情況和LC3-Ⅱ的周轉進行了分析，結果證實PRRSV感染后促進了p62的降解同時也促進了LC3-Ⅱ的周轉。充分表明了PRRSV感染可以促進自噬體的降解。
　　 3.細胞自噬促進PRRSV的增殖
　　 研究中分別通過自噬抑制劑3-MA和自噬激活劑雷帕霉素

6、(Rapa)處理細胞，檢測抑制或激活細胞自噬對PRRSV增殖的影響。結果發(fā)現(xiàn)誘導細胞自噬促進PRRSV的增殖，而3-MA抑制細胞自噬后，PRRSV的增殖受到抑制。進一步，通過設計干擾分子分別干擾ATG7和Beclin-1的表達，進一步證明細胞自噬在PRRSV增殖過程中的促進作用。另外，通過抑制劑和干擾分子分別抑制自噬溶酶體的形成，同樣顯著抑制了PRRSV的增殖。以上結果表明細胞自噬能夠促進PRRSV的增殖。
　　 4.參與誘導細

7、胞自噬的PRRSV編碼蛋白
　　 為篩選參與誘導細胞自噬的PRRSV編碼蛋白，首先用紫外光(UV)滅活的PRRSV感染MARC-145細胞，結果發(fā)現(xiàn)UV滅活的PRRSV不具有誘導細胞自噬的能力，初步推斷誘導細胞自噬的為PRRSV的非結構蛋白。進一步通過轉染PRRSV編碼蛋白的真核表達質粒，并通過WesternBlot檢測LC3-Ⅱ的表達變化情況，結果顯示多種PRRSV編碼的非結構蛋白均可誘導細胞自噬。
　　 5.PRRS

8、V誘導的細胞自噬參與免疫抑制
　　 PRRS是一種強烈的免疫抑制性疾病，現(xiàn)已證實，PRRSV感染可以抑制由poly(I(:)C)誘導的干擾素的表達，而在對細胞自噬研究的過程中現(xiàn)已證實細胞自噬可以引起干擾素的下調。為此，我們通過熒光素酶報告質粒檢測PRRSV誘導的細胞自噬是否參與其引起的免疫抑制，結果表明細胞自噬被抑制后PRRSV引起的免疫抑制得到恢復，這表明PRRSV誘導的細胞自噬參與其引起的免疫抑制。
　　 6.PRR

9、SV感染MARC-145細胞誘導內質網應激
　　 PRRSV感染細胞后，通過電鏡觀察其內質網的形態(tài)變化情況。發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后可以引起內質網的擴張，推斷PRRSV感染可以引起內質網應激;進一步通過WesternBlot檢測了糖調節(jié)蛋白78和94（GRP78和GRP94）的表達變化情況，證實PRRSV感染后可顯著誘導GRP78和GRP94的表達。表明PRRSV感染誘導了內質網應激并誘發(fā)了內質網應激反應。
　　 7.PRR

10、SV感染MARC-145細胞激活PERK途徑
　　 活化的PERK可以磷酸化轉錄起始因子2α(eIF2α)，為此本研究通過WesternBlot檢測了PRRSV感染后eIF2α的磷酸化水平，證實了PRRSV感染MARC-145細胞后eIF2α磷酸化水平顯著升高，而總的eIF2α未發(fā)生變化。進一步我們檢測了ATF4的mRNA的表達變化情況，證實了磷酸化的eIF2α可以誘導ATF4的表達，最后研究證實了PRRSV感染后GADD34的

11、表達水平也明顯升高，這充分證明了PRRSV感染MARC-145細胞后，PERK的通路被激活。
　　 8.PRRSV感染MARC-145細胞激活IRE1途徑
　　 首先通過半定量的方法檢測了IRE1所誘導的Xbp1mRNA的切割情況，并最早在PRRSV感染24h后檢測到Xbp1s的存在，證實了PRRSV感染可以誘導Xbp1的切割，上述結論進一步通過Xbp1的熒光素報告質粒得到了佐證。之后通過熒光素酶報告質粒對受Xpb1調控

12、的兩個反應元件（ERSE和UPRE）的活化進行驗證，結果表明ERSE和UPRE在PRRSV感染后都被激活，最后通過熒光定量驗證了受Xpb1調控的EMEM在PRRSV感染后同樣被激活，充分證明了PRRSV感染可以激活IRE1途徑。
　　 9.PRRSV感染MARC-145細胞不激活ATF6途徑
　　 ATF6的激活要通過切割實現(xiàn)，研究中通過WesternBlot檢測了PRRSV感染后ATF6的切割情況。發(fā)現(xiàn)PRRSV感染并

13、不誘導ATF6的切割，初步推測PRRSV感染不激活ATF6途徑;進一步通過熒光定量PCR檢測了ATF6下游分子的表達變化情況，結果發(fā)現(xiàn)PRRSV感染不能誘導其下游分子calnexin，calreticulin和PDI的表達，進一步證實PRRSV感染不能激活ATF6信號通路。
　　 10.內質網應激反應促進PRRSV增殖
　　 內質網應激反應通常會影響病毒的增殖，為檢測PRRSV誘導的內質網應激對其自身增殖的影響，本研究分

14、別通過內質網應激的抑制劑和干擾分子阻斷內質網應激反應，并進一步通過空斑驗證其對PRRSV增殖的影響。結果顯示，無論是抑制內質網應激反應，還是分別干擾其單條通路均能抑制PRRSV的增殖。
　　 11.PRRSV感染誘導內質網應激介導的凋亡
　　 PERK誘導的CHOP的表達通常被認為是內質網應激誘導凋亡的重要標志。為此，我們首先通過CHOP的熒光素報告質粒證實了PRRSV感染后可以顯著激活CHOP的表達，進一步通過熒光定量

15、PCR對CHOP的mRNA的表達水平進行了驗證，同樣證實了PRRSV感染可以誘導CHOP的mRNA的表達。此外，本研究進一步通過ELISA試劑盒證實了PRRSV感染可以誘導caspase3的活化，直接證明了PRRSV感染可以誘導細胞凋亡。而當CHOP的表達被干擾后，caspase3的活化受到抑制，充分證明PRRSV感染可以誘導由內質網應激引起的細胞凋亡。
　　 12.PRRSV誘導的內質網應激調控細胞自噬
　　 研究發(fā)現(xiàn)