豬鏈球菌2型多重耐藥膜相關(guān)蛋白篩選.pdf

1、豬鏈球菌2型現(xiàn)有的耐藥機制多局限于研究某一機制的個別基因及蛋白,難以解釋細菌多重耐藥產(chǎn)生的全部現(xiàn)象,更不能全面揭示細菌多重耐藥的分子基礎(chǔ)及機制。為此,我們擬采用人工誘導的方法,在實驗室誘導出豬鏈球菌2型多重耐藥菌株,在此基礎(chǔ)上,運用蛋白組學技術(shù),尋找耐藥相關(guān)的蛋白,并通過實時熒光定量PCR的方法對實驗結(jié)果進行驗證。由此來探究豬鏈球菌在多重耐藥產(chǎn)生過程中獲得耐藥性的主要方式及其共存的耐藥機制。具體研究內(nèi)容如下:
　　 1豬鏈球菌多

2、重耐藥菌株的誘導
　　 本文采用微量稀釋法測定了臨床分離的38株豬鏈球菌對6種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)；將其中3株同時對紅霉素、環(huán)丙沙星敏感的菌株采用體外遞增藥物濃度的方法分別誘導其對紅霉素、環(huán)丙沙星同時耐藥,測定親本株與誘導株的MIC,并用外排泵抑制劑利血平聯(lián)合用藥探究其對豬鏈球菌耐藥株耐藥性的影響；采用PCR和基因測序的方法分析了誘導菌株的ermB、ermA、ermC、mefA、msrD、mphB、tetM、tetO

3、、tetL、tetK、核糖體23S rRNA、核糖體蛋白L4、L22及DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ(parC和parE)耐藥決定區(qū)(QRDR)的基因突變和氨基酸序列變化。結(jié)果表明:臨床分離的豬鏈球菌對紅霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率分別達39.5％(15/38)、28.9％(11/38),對磺胺間甲氧嘧啶及四環(huán)素均耐藥,對氨芐西林、氟苯尼考均敏感；用紅霉素和環(huán)丙沙星采用濃度遞增法成功誘導了豬鏈球菌對紅霉素及環(huán)丙沙星耐藥；環(huán)丙

4、沙星與利血平聯(lián)合用藥時,其MIC值顯著降低,但紅霉素與利血平聯(lián)合用藥時,MIC值基本沒有變化；PCR及測序結(jié)果顯示誘導的多藥耐藥菌株無外源耐藥基因ermB、ermA、ermC、mefA,msrD、mphB,但檢測到tetM和tetO及氟喹諾酮靶位DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ(parC和parE)耐藥決定區(qū)(QRDR)的突變。
　　 2豬鏈球菌敏感株與誘導耐藥株雙向凝膠電泳試驗
　　 為了分離豬鏈球菌臨

5、床敏感株和誘導耐藥株的差異蛋白質(zhì),篩選與豬鏈球菌產(chǎn)生多重耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)分子,進一步揭示豬鏈球菌產(chǎn)生耐藥性的相關(guān)耐藥機制,本實驗通過Triton X-114法分別提取兩種細菌的膜相關(guān)蛋白,進行等電點聚焦和SDS-聚丙烯胺凝膠電泳,對所得膠圖利用ImageMaster5.0軟件進行分析。在此基礎(chǔ)上,選取差異點進行質(zhì)譜分析,對分析結(jié)果進行數(shù)據(jù)庫檢索。通過實驗得到了分辨率較好的雙向凝膠電泳圖譜,在敏感株與耐藥株膜蛋白圖譜中分別檢出(311±5

6、3)和(237±53)個蛋白質(zhì)斑點,初對其中的9個差異蛋白質(zhì)斑點切取并進行了MALDI-TOF-MS分析。將原始質(zhì)譜文件輸入并查尋NCBI數(shù)據(jù)庫,搜索后均匹配得到與豬鏈球菌相關(guān)的蛋白質(zhì)點,每個蛋白質(zhì)點有一到多個蛋白群組成.由此發(fā)現(xiàn),在豬鏈球菌臨床敏感株和誘導耐藥株之間存在差異表達蛋白,通過對雙向凝膠電泳有關(guān)條件進行優(yōu)化,可將這些蛋白質(zhì)斑點有效分離,己鑒定的蛋白質(zhì)與細菌的新陳代謝、毒力、耐藥性等有關(guān),可為進一步研究豬鏈球菌多重耐藥機制提供

7、線索。
　　 3實時熒光定量RT-PCR檢測耐藥相關(guān)差異蛋白的mRNA表達水平
　　 為了進一步研究蛋白質(zhì)組學實驗中發(fā)現(xiàn)的多藥耐藥相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運蛋白在細菌耐藥性產(chǎn)生過程中的作用,本文通過熒光定量PCR的方法測定了環(huán)丙沙星敏感豬鏈球菌菌株JR05730及其誘導的環(huán)丙沙星中介菌株JR05730-M和耐藥菌株JR05730-EC中該轉(zhuǎn)運蛋白對應基因SS2069mRNA的表達情況.結(jié)果表明:隨著細菌耐藥性的加強,中介菌和耐藥菌S