表達(dá)雞新城疫病毒HN基因重組雞痘病毒活疫苗的臨床前研究.pdf

1、雞新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的家禽最嚴(yán)重的傳染病之一。NDV的病毒囊膜含有2個(gè)主要的糖蛋白,即融合蛋白(F)和血凝素—神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN),它們都被用于重組雞痘病毒疫苗的研究。本研究從我們實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的單表達(dá)、共表達(dá)新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)和血凝素—神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)基因的重組雞痘病毒中篩選一個(gè)作為疫苗候選株,進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn),并在GMP條件下完成中間試制,為新城疫重組雞痘病毒活疫苗順利進(jìn)入臨床試驗(yàn)打

2、好了基礎(chǔ)。
　　 1.單表達(dá)和共表達(dá)NDV F和HN基因重組雞痘病毒活疫苗的免疫效力比較試驗(yàn)
　　 為評(píng)價(jià)母源抗體對(duì)抗新城疫(ND)重組雞痘病毒(rFPV)活疫苗免疫效力的影響,本研究用單表達(dá)、共表達(dá)NDV基因Ⅶ型病毒ZJ1株F、HN基因的rFPV活疫苗rFPV-12L,SF、rFPV-12LSHN、rFPV-12LSFHN和油乳劑滅活疫苗分別免疫14日齡商品蛋雞,重組雞痘病毒疫苗的免疫劑量均為2×104PFU,免疫后2

3、1d分別用106ELD50NDV不同強(qiáng)毒株攻毒。其中F48E8株攻毒的免疫保護(hù)率分別為30.3％、73.2％、41.1％、89.3％;而ZJ1株攻毒的免疫保護(hù)率分別為35.8％、67.9％、78.6％、100％。用表達(dá)雞IL-2基因的重組雞痘病毒rFPV-12L,SIL-2與rFPV-12LSHN聯(lián)合免疫沒(méi)有提高rFPV-12LSHN疫苗的免疫保護(hù)力。試驗(yàn)結(jié)果表明,單表達(dá)NDV HN基因的重組雞痘病毒rFPV-12LSHN可作為ND活疫

4、苗候選株,為ND重組雞痘病毒活疫苗的進(jìn)一步應(yīng)用性開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒的部分生物學(xué)特性研究
　　 為了評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因?qū)﹄u痘病毒(FPV)生物學(xué)特性的影響,通過(guò)電鏡觀察重組雞痘病毒(rFPV)感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),結(jié)果表明在FPV中插入NDV血凝素—神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)基因(rFPV-12LSHN)后,不改變r(jià)FPV的形態(tài)、病毒成熟過(guò)程。rFPV-12LSHN與FPV在CE

5、F上的產(chǎn)量無(wú)顯著差異。rFPV-12LSHN接種11日齡雞胚,在尿囊膜(CAM)上觀察到典型痘斑或水腫,雞胚最小感染量≤100PFU。免疫熒光試驗(yàn)證明,rFPV-12LSHN在CEF上傳代能穩(wěn)定表達(dá)NDV HN抗原。rFPV(103PFU/羽)接種SPF雞快速誘導(dǎo)NDV HI抗體應(yīng)答,免疫3周后完全保護(hù)NDV強(qiáng)毒攻擊。
　　 3.表達(dá)新城疫HN基因的重組雞痘病毒活疫苗的免疫持續(xù)期和加強(qiáng)免疫研究
　　 為了評(píng)價(jià)表達(dá)新城疫病

6、毒(NDV)血凝素—神經(jīng)氨酸酶(HN)基因的重組雞痘病毒(rFPV-12LSHN)活疫苗的免疫持續(xù)期和加強(qiáng)免疫對(duì)疫苗免疫效力的影響。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日齡SPF雞,103PFU/羽,7 d即可檢測(cè)到NDV HI抗體應(yīng)答,對(duì)NDV強(qiáng)毒F48E8株攻毒保護(hù)率達(dá)100％。一次免疫18周后,對(duì)NDV強(qiáng)毒攻擊依然提供完全保護(hù)。雞痘病毒(FPV)疫苗免疫4周,再接種rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保護(hù)率降低至50％。相反,rF

7、PV-12LSHN免疫4周,隨后二次免疫可顯著提高對(duì)NDV的體液免疫應(yīng)答水平(P＜0.01),對(duì)NDV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)率沒(méi)有影響。結(jié)果表明,表達(dá)NDV HN基因的重組雞痘病毒(rFPV-12LSHN)活疫苗,能夠快速建立堅(jiān)強(qiáng)免疫力,免疫持續(xù)期至少可達(dá)18周,rFPV-12LSHN的二次免疫可以提高疫苗的免疫力。
　　 4.重組雞痘病毒活疫苗X-gal染色空斑計(jì)數(shù)法的建立
　　 建立了一種簡(jiǎn)易的攜帶LacZ基因重組雞痘病毒(

8、rFPV)活疫苗的X-gal染色空斑計(jì)數(shù)法。rFPV接種次代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)72h后,加2mL/L戊二醛固定液室溫固定15min,再加500ug/mL X-gal染色液37℃過(guò)夜,倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)藍(lán)染空斑。染色空斑計(jì)數(shù)法的空斑數(shù)是不染色直接計(jì)數(shù)法的1.6-3.3倍。該方法在重組雞痘病毒活疫苗研究及其工業(yè)化生產(chǎn)檢驗(yàn)中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。
　　 5.雞新城疫重組雞痘病毒活疫苗的中試生產(chǎn)
　　 為了給臨床試驗(yàn)提供疫

9、苗,在GMP條件下進(jìn)行了雞新城疫重組雞痘病毒活疫苗(rFPV-ND-HN)的中試生產(chǎn)。CEF作為制苗材料,培養(yǎng)于10000ml轉(zhuǎn)瓶,按0.2PFU/細(xì)胞接種毒種rFPV-12LSHN,37℃12轉(zhuǎn)/h旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),待細(xì)胞病變達(dá)到80％,收獲感染細(xì)胞,加適量的5％蔗糖—脫脂奶粉,隨后凍干。共生產(chǎn)了5批rFPV-ND-HN凍干疫苗,質(zhì)量指標(biāo)全部達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。
　　 總結(jié)
　　 1.篩選出單表達(dá)NDV HN基因的重組雞痘病毒(rF

10、PV-12LSHN)作為疫苗候選株。
　　 2.rFPV-12LSHN與親本毒株FPV-LP在CEF細(xì)胞內(nèi)的病毒形態(tài)、繁殖方式以及病毒產(chǎn)量沒(méi)有明顯變化。
　　 3.rFPV-12LSHN活疫苗,能夠快速建立堅(jiān)強(qiáng)免疫力,免疫持續(xù)期至少可達(dá)18周。
　　 4.rFPV-12LSHN的二次免疫可以顯著提高疫苗的NDV HI抗體應(yīng)答。
　　 5.建立了一種簡(jiǎn)易、快速、敏感的重組雞痘病毒活疫苗的X-gal染色空斑計(jì)