銅綠假單胞菌的鑒定及重組外膜蛋白免疫效果的初步研究.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國淡水池塘養(yǎng)殖主要品種之一，養(yǎng)殖過程易受病原體的侵襲而導(dǎo)致病害發(fā)生。細(xì)菌性腸炎病、爛鰓病、赤皮病，病毒性出血病以及寄生蟲病等均可引起草魚大量死亡，給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。本課題組從患類似赤皮病的草魚體上的分離純化到一株優(yōu)勢菌株。病魚體表局部出血發(fā)炎，以腹部最為嚴(yán)重，鰭條基部充血、末端腐爛草魚。本研究對該菌株進(jìn)行了鑒定，確定其為銅綠假單胞菌，并進(jìn)行藥敏試驗分析。同時進(jìn)行外膜蛋白o(hù)

2、prl以及外膜蛋白o(hù)prF和oprl融合蛋白的基因工程表達(dá)研究，分析其免疫原性，為草魚銅綠假單胞菌疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　 1病原菌的分離、鑒定和藥敏試驗分析
　　 從患病草魚體表病灶上分離到一株優(yōu)勢菌，回歸感染試驗顯示該菌株能感染草魚，且具較強(qiáng)毒力。對該病菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察和主要理化特性分析，初步鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。進(jìn)一步對該菌進(jìn)行分子鑒定，共選用16S rRNA、RN

3、A聚合酶β亞單位(rpoB)和促旋酶亞單位蛋白(gyrB)3個基因進(jìn)行鑒定分析。序列克隆與BLAST分析顯示，這3個基因均與GenBank上登錄的銅綠假單胞菌的相應(yīng)序列具有很高的同源性。16S rRNA基因、rpoB基因和gyrB與已知銅綠假單胞菌相應(yīng)序列的同源性分別在9g％、98％和93％以上.綜合生理生化與分子鑒定結(jié)果，可判定所分離的菌株為銅綠假單胞菌.藥敏實驗顯示該菌對阿米卡星、菌必治、氟哌酸和妥布霉素等11種藥物高度敏感，對鏈霉

4、素和慶大霉素中度敏感，對羅紅霉素、紅霉素、四環(huán)素、苯唑青霉素、新霉素和頭孢氨芐等16種藥物具有耐藥性。
　　 2外膜蛋白o(hù)prF和oprl基因克隆、原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)
　　 克隆了銅綠假單胞菌外膜蛋白o(hù)prF和oprl基因的完整開放閱讀框，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測。預(yù)測結(jié)果顯示oprl的67-252片段、oprF的568-1026片段具有較強(qiáng)免疫原性。利用原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30構(gòu)建帶此oprl基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒pQ

5、E-oprl，以及帶有oprF的568-1026和oprl的67-252串聯(lián)序列的表達(dá)質(zhì)粒pQE-oprF-I.重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株、誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-FAGE檢測到與預(yù)期大小相符的蛋白條帶，且蛋白均為可溶性表達(dá)。經(jīng)HisBind柱純化獲得重組蛋白F-I和I。
　　 3重組外膜蛋白o(hù)prI和oprF-I免疫原性分析
　　 重組蛋白F-I和I，分別加入弗氏不完全佐劑后免疫草魚。Western blotti

6、ng方法檢測免疫組草魚抗體的產(chǎn)生。結(jié)果顯示重組FI蛋白免疫組在約36kDa和12kDa處的出現(xiàn)特異性條帶，重組Ⅰ蛋白免疫組在12kDa處出現(xiàn)單一條帶，說明二種重組蛋白均具有較強(qiáng)的免疫原性，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能與銅綠假單胞菌中的F和I蛋白特異結(jié)合。Elisa檢測顯示重組F蛋白免疫組草魚血清抗體滴度達(dá)到800，重組Ⅰ蛋白免疫組的達(dá)到800，說明受免草魚均產(chǎn)生了較高的特異性抗體。采用qRT-PCR檢測草魚頭腎與脾臟IgM基因和G型溶菌酶基因的mR