CMO啟動子驅(qū)動CMO基因在煙草中的表達(dá).pdf

1、甜菜堿是一種非毒性的小分子滲透調(diào)節(jié)劑,多種高等植物在鹽堿或干旱的環(huán)境下在細(xì)胞中積累甜菜堿,以維持細(xì)胞正常的膨壓。在植物中甜菜堿是由膽堿經(jīng)兩步反應(yīng)生成的,催化第一步反應(yīng)的酶是膽堿單加氧酶(choline monooxygcnase,CMO)。本實驗室的前期工作中分離了遼寧堿蓬CMO基因、CMO啟動子,發(fā)現(xiàn)CMO啟動子(pC:-267～+1bp)是鹽誘導(dǎo)啟動子,在400mmol/L NaCl條件下處理時,其驅(qū)動的GUS基因活性是未經(jīng)NaCl

2、誘導(dǎo)時的5倍。本文構(gòu)建了pC啟動子驅(qū)動CMO基因的植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化煙草,分析pC啟動子驅(qū)動CMO基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因煙草的甜菜堿含量,為脅迫誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動外源基因的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。具體工作及結(jié)果如下:
　　 利用PCR技術(shù)從克隆載體pUCl9-CMO中擴增出約1.3kb的CMO基因編碼區(qū),經(jīng)過酶切、連接,替代表達(dá)載體pCAMBIA1301-pC-GUS中的GUS基因獲得新的表達(dá)載體pCAMBIA1301-pC-C

3、MO。
　　 凍融法將pCAMBIA1301-pC-CMO導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,獲得工程菌LBA4404-pCAMBIA1301-pC-CMO。
　　 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將pCAMBIA1301-pC-CMO、pBI121-CMO(CaMV35S啟動子驅(qū)動CMO基因)轉(zhuǎn)入煙草,PCR檢測獲得陽性植株。半定量RT-PCR檢測表明,35S-CMO轉(zhuǎn)基因煙草

4、CMO基因的表達(dá)量高于pC-CMO轉(zhuǎn)基因煙草；甜菜堿含量檢測表明,pC-CMO轉(zhuǎn)基因煙草甜菜堿含量與野生煙草的甜菜堿含量相近或略高于野生煙草的甜菜堿含量,35S-CMO轉(zhuǎn)基因煙草中的甜菜堿含量高于pC-CMO轉(zhuǎn)基因煙草。
　　 100mmol/L NaCl脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草24h后,pC-CMO轉(zhuǎn)基因煙草中CMO基因表達(dá)量高于35S-CMO轉(zhuǎn)基因煙草,與此相對應(yīng),pC-CMO轉(zhuǎn)基因煙草中甜菜堿含量均提高,而野生型煙草和