病原誘導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)錄因子TaPIMP1基因的特性及功能研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著生態(tài)環(huán)境的不斷變化，我國(guó)的小麥生產(chǎn)正遭受日益嚴(yán)重的疾病侵害，同時(shí)也受到極端氣候的影響。特別是小麥紋枯病、根腐病等病害，以及干旱、寒冷等極端天氣都對(duì)我國(guó)小麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。本文以病原誘導(dǎo)的小麥MYB轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其表達(dá)特性、轉(zhuǎn)錄因子部分性質(zhì)以及在轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因小麥中的功能進(jìn)行了初步研究。
　　 本論文取得以下結(jié)果：
　　 1.初步明確了TaPIMP1基因的表達(dá)特性。熒光定量PCR結(jié)果表明，

2、用小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）和紋枯病菌（Rhizotonia cerealis）對(duì)小麥葉片進(jìn)行接種后，在葉片中TaPIMP1的表達(dá)量都相對(duì)提高，并且對(duì)小麥根腐菌的反應(yīng)相對(duì)于紋枯菌的較為迅速。在根腐菌接種6h的時(shí)候TaPIMP1表達(dá)上調(diào)3倍，在48h時(shí)該基因表達(dá)量最高、上調(diào)了11倍。而在對(duì)紋枯病菌的反應(yīng)中，TaPIMP1的表達(dá)量在紋枯病菌接種12h時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，表達(dá)量上調(diào)3倍。用防衛(wèi)相關(guān)植物激素水楊酸SA

3、、茉莉酸JA、乙烯ET和脫落酸ABA對(duì)小麥葉片進(jìn)行處理，研究這些激素是否誘導(dǎo)小麥葉片中TaPIMP1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果表明，只有脫落酸ABA對(duì)該基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用明顯。
　　 2.明確了TaPIMP1蛋白具有核定位的特性，優(yōu)化了TaPIMP1蛋白的原核表達(dá)和純化條件。構(gòu)建了TaPIMP1-GFP融合蛋白載體，并用基因槍將該載體打入洋蔥表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)后觀察表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞中的定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TaPIMP1-GFP融合蛋白集

4、中分布在細(xì)胞核中，而對(duì)照GFP在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，證明了TaPIMP1具有核定位的特性；為研究TaPIMP1蛋白的體外生化性質(zhì)，構(gòu)建了TaPIMP1-GST融合蛋白的原核表達(dá)載體，并將該載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在原核表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，0.1mM IPTG的誘導(dǎo)濃度、16℃的誘導(dǎo)溫度以及12h誘導(dǎo)時(shí)間，是TaPIMP1-GST融合蛋白表達(dá)的合適條件，能較好地避免包涵體的形成。
　　 3.明確了TaP

5、IMP1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的抗病和抗逆功能。通過(guò)卡那霉素抗性篩選以及PCR分子檢測(cè)，篩選到轉(zhuǎn)TaPIMP1基因陽(yáng)性的煙草植株，通過(guò)半定量RT-PCR進(jìn)一步分析，獲得一些過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的葉片進(jìn)行青枯病菌接種，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草葉片對(duì)青枯病有非常明顯的抗性。對(duì)轉(zhuǎn)TaPIMP1基因煙草及其轉(zhuǎn)基因煙草受體的葉片進(jìn)行模擬脫水（20％PEG6000溶液）、高鹽（100mM NaCl溶液）以及氧化還原(300μM甲

6、基紫精)處理，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草葉片有較好的抗旱、抗鹽以及抗氧化還原效果。通過(guò)對(duì)煙草植株進(jìn)行干旱和高鹽處理，發(fā)現(xiàn)與野生型煙草W38相比，轉(zhuǎn)TaPIMP1基因煙草的部分株系對(duì)干旱和鹽處理具有良好的抗性。表明過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株也具有較強(qiáng)的抗旱和抗鹽效果。對(duì)部分轉(zhuǎn)基因株系以及野生型煙草W38的葉片進(jìn)行總蛋白提取，測(cè)定其生理活性，結(jié)果表明，相對(duì)于野生型煙草，轉(zhuǎn)基因株系的苯丙氨酸解氨酶活性和SOD活性明顯提高。
　　 4.通過(guò)

7、對(duì)轉(zhuǎn)TaPIMPI基因小麥的分子檢測(cè)和抗病性分析，初步明確了TaPIMP1過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)根腐病和紋枯病的抗性。轉(zhuǎn)TaPIMP1基因小麥（揚(yáng)麥12號(hào)）T0-T1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得了一批較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)TaPIMP1基因小麥材料，篩選出TaPIMP1過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥材料。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)TaPIMP1基因小麥進(jìn)行根腐病菌和紋枯病菌接種、抗病性鑒定，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)TaPIMP1基因陽(yáng)性的個(gè)麥植株對(duì)紋枯病菌、根腐菌的抗性提高，說(shuō)明TaPIM