馬鈴薯黑脛病菌實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）作為世界上糧菜兼用型作物之一，在人們的日常生活和國民經(jīng)濟(jì)中起著舉足輕重的作用。但是病害多，發(fā)生頻繁，往往造成馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅度下降，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收，其中馬鈴薯細(xì)菌性病害的發(fā)生較為普遍。馬鈴薯黑脛?。‥rwinia carotovora subsp. Atroseptica）是國內(nèi)外馬鈴薯產(chǎn)區(qū)發(fā)生比較普遍的一種細(xì)菌性病害，嚴(yán)重地影響了馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量。本試驗(yàn)從內(nèi)蒙、黑龍江、甘肅、廣

2、西以及廣東馬鈴薯主要產(chǎn)地采集了10個(gè)疑似馬鈴薯黑脛病菌株。以此建立馬鈴薯黑脛病菌分離、純化、保存、致病性鑒定體系；通過設(shè)計(jì)的PCR引物對馬鈴薯黑脛病菌進(jìn)行擴(kuò)增、測序；根據(jù)序列進(jìn)行黑脛病菌實(shí)時(shí)定量熒光PCR引物的設(shè)計(jì)、檢測、分析；對不同的檢測馬鈴薯黑脛病菌方法的靈敏度進(jìn)行比較。主要結(jié)果如下：
　　 （1）本試驗(yàn)獲得了10個(gè)馬鈴薯黑脛病菌株。對結(jié)晶紫果膠酸鹽（CVP）培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。鑒定了三種典型的馬鈴薯黑脛病菌均有致病力。

3、>　　 （2）對10個(gè)菌株的細(xì)菌提取DNA后，根據(jù)下載序列設(shè)計(jì)引物Eca1g（5′GAAACCGTCA CGCTGGATAAC3′）Eca2g （3 ′AAGGTGTTGGGCAGATTGAGT5′）對供試菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得目的片段大小為681bp 。測定了該引物的退火溫度56.4 ℃和反應(yīng)體系中Mg2+的濃度是2.5 mM ；PCR 驗(yàn)證引物特異性試驗(yàn)中，該引物有著較高的特異性。對馬鈴薯黑脛病菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定

4、。
　　 （3）根據(jù)測定的序列設(shè)計(jì)出檢測馬鈴薯黑脛病菌的實(shí)時(shí)定量熒光PCR 特異性引物Yg1（5′GAATATCAATAGCACTATCCTCAG3′）Yg2（5′CACATTATCAACCAACAGAACC3′）。獲得目的片段大小為181bp 。對10種供試菌株進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測。在實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測體系中，靶標(biāo)菌株擴(kuò)增曲線平滑，溶解曲線主峰明顯，結(jié)果較為可靠。每兩個(gè)重復(fù)的曲線基本重合，CT值也十分相近，表明重復(fù)

5、性好。
　　 （4）對馬鈴薯黑脛病菌的三種檢測方法的靈敏度進(jìn)行了比較。將靶細(xì)胞菌液依次稀釋十倍，3.6~3.9×107cfu/mL至3.6~3.9×10-1cfu/mL共9個(gè)梯度，陰性為滅菌超純水。分別進(jìn)行CVP培養(yǎng)基檢測、常規(guī)PCR檢測、實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測。將檢測的靈敏度進(jìn)行比較。CVP培養(yǎng)基檢測出最低的黑脛病菌濃度為3.1×102cfu/mL 。常規(guī)PCR檢測出最低的黑脛病菌濃度為36~39cfu/mL。實(shí)時(shí)定量熒光PC