煙草花葉病毒外殼蛋白誘導(dǎo)煙草抗病毒作用.pdf

1、植物誘導(dǎo)抗病性是在誘導(dǎo)因子的作用下，激活植物自身的抗病機制來抵抗病原物的侵染?？共≌T導(dǎo)劑的開發(fā)與利用在植物防治上開辟了一個新的領(lǐng)域，利用抗病誘導(dǎo)劑來防治植物病毒病也是植物病毒病防治的理想選擇。 本研究以煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)為材料，制備了臭氧處理的TMV-CP和融合表達(dá)的TMV-CP這兩種誘導(dǎo)劑，通過涂抹煙草，研究寄主植物的抗病反應(yīng)。主要的研究結(jié)果如下： 從感染TMV的發(fā)病煙草葉片中

2、提取病毒，提純病毒通入6g/L臭氧滅活10分鐘，再透析處理得到了臭氧處理的TMV-CP。 提取被TMV侵染的煙草葉片總RNA，擴增CP(CoatProtein)基因，將擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)同源性分析表明，與TMV-U1株系同源性為99％。將目的片段克隆到原核表達(dá)載體pET-29a上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)誘導(dǎo)后超聲波

3、破碎所得融合蛋白以不可溶的形式存在。SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，表達(dá)產(chǎn)物與目的蛋白大小一致。用磷酸緩沖液(Phosphatebuffersolution，PBS)配制融合蛋白，制備成融合表達(dá)的TMV-CP。 分別用臭氧處理的TMV-CP和融合表達(dá)的TMV-CP(10μg/mL)分別涂抹煙草，三天后再接種TMV，一周后用ELISA(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)法測定表明，臭氧處理

4、的TMV-CP誘導(dǎo)植株接種葉片的病毒相對濃度(OD值)是陽性對照的33.6％，融合表達(dá)的TMV-CP誘導(dǎo)植株接種葉片的病毒相對濃度(OD值)是陽性對照的47.5％，說明兩種TMV-CP均可誘導(dǎo)煙草抗TMV的侵染。 通過對病毒-寄主互作中相關(guān)防御酶POD(過氧化物酶)、PPO(多酚氧化酶)、PAL(丙氨酸解氨酶)、SOD(超氧化物歧化酶)活性及葉綠素含量和MDA(丙二醛)含量的測定，結(jié)果表明臭氧處理的TMV-CP、融合表達(dá)的TMV

5、-CP均能誘導(dǎo)煙草體內(nèi)的防御酶活性增強，降低被TMV感染葉片中膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量，以及阻止TMV感染造成的煙草葉綠素、可溶性糖和蛋白含量的降低。對POD、PPO兩種酶的同工酶譜和病程相關(guān)蛋白譜的觀察，結(jié)果表明，兩種TMV-CP蛋白還能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生1條健葉和病葉所沒有的同工酶譜帶，而且還可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生1條健葉所沒有且比接種葉片表達(dá)量高的病程相關(guān)蛋白譜帶。說明臭氧處理的TMV-CP和融合表達(dá)的TMV-CP對寄主具有某種程度的誘導(dǎo)抗性